三次元レンダリングとカルビンディン抗体、解析人間の胎盤絨毛血管のネットワークを明らかにしました。

この手順の全体的な目標は、胎盤絨毛樹片の3Dレンダリングを生成し、それらに含まれる血管網の分析に適したものにすることです。この方法は、なぜ子供が成長が制限されるのか、どのようなストレスが、早産につながったのか、そのストレスがどれほど深刻であったのかなど、私たちの分野での重要な質問に答えるのに役立ちます。私たちの手順の主な利点は、透明な胎盤絨毛樹組織を免疫標識し、それらの血管ネットワークを視覚化し、それらの視覚化を使用してこれらの血管ネットワークを特徴付けおよび分析する立場にあることです。

この手法の意味は、ほとんどの生命科学が2次元の組織学的特性評価に依存しているため、多くの診断や治療にまで及ぶ可能性があります。手順を実演するのは、胎盤組織の免疫標識と透明化を行うValerie Schwenk氏であり、次にPhillip Necaise氏が胎盤組織の解剖を行い、組織の逆の透明化も行います。絨毛樹の解剖の準備をするには、まず、フォーマルで固定された胎盤組織をリン酸緩衝生理食塩水ですすいでください。

次に、解剖顕微鏡のステージ上のシャーレに入れます。絨毛の木を見つけるには、メスと細い鉗子を使用して胎盤組織を引き裂きます。次に、長さ約5ミリメートルの絨毛樹の断片を解剖し、1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水を含むマイクロチューブに移します。

リン酸緩衝生理食塩水を新しい生理食塩水と交換し、時折渦巻きながら10分間待ちます。次に、リン酸緩衝生理食塩水を透過化緩衝液に置き換えて、組織を透過化し、二次抗体の非特異的結合をブロックします。その後、30分間インキュベートします。

次に、透過化緩衝液を、マウスモノクローナル抗CD31およびウサギ抗CK7を含む2%ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水に置き換えます。ティッシュを摂氏4度で一晩放置します。翌日、リン酸緩衝生理食塩水と2%ヤギ血清でさらに洗浄して、残りの抗体を除去します。

次に、リン酸緩衝生理食塩水を2%ヤギ血清で除去し、同じ緩衝液を添加し、ヤギ抗マウス免疫グロブリンGと緑色蛍光色素、ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンGと赤外線蛍光色素を併用します。室温で暗所で30分間インキュベートします。その後、ティッシュをPBS-GSで一度洗浄し、標識したティッシュを室温で透明になるまで暗所で保管します。

サンプルをPBSで10分間隔で3回洗浄します。組織を脱水するには、リン酸緩衝生理食塩水を除去し、組織に50%エタノールを加えて10分間インキュベートします。インキュベーション後、廃棄し、続いて70%エタノールで10分間隔で3回洗浄し、続いて100%エタノールで15分間隔で3回洗浄します。

次に、先端の細い鉗子を使用して、組織を1ミリリットルの溶液で満たされたマイクロチューブに4時間移します。4時間後、組織を溶液2で満たされたマイクロチューブに移し、さらに4時間インキュベートします。組織をサイクス・ムーア・チャンバーに装着するには、先端の細い鉗子を使用して、チャンバーベースに25mmの丸いカバースリップを配置します。

再度、細い先端の鉗子を使用して、カバースリップのベースにゴム製のガスケットを配置します。溶液2に浸したティッシュを取り出し、カバースリップの中央に置きます。次に、溶液2(約40マイクロリットル)を組織に一滴加えます。

次に、2枚目のカバースリップを取り、ガスケットの上に置きます。次に、ベースの上部にロックリングを通して、カバースリップとガスケットをしっかりと圧縮します。次に、ガスケットを通して25ゲージの針をベースのポートに挿入します。

次に、3ミリリットルの注射器に1点5ミリリットルの溶液2を入れます。次に、25ゲージの針をシリンジに取り付け、ガスケットを介して反対側のポートに針を挿入します。次に、チャンバーに溶液2を注入し始め、チャンバー内の空気が他の25ゲージニードルから排出されていることを確認します。

チャンバーがいっぱいになったら、針とシリンジを取り外し、Sykes-Mooreチャンバーホルダーを共焦点顕微鏡ステージに置きます。10倍対物レンズを使用して、チャンバーに組織を集中させます。次に、ステージの基準点を設定し、顕微鏡ステージを焦点面を介して上下に動かして、組織の上下を特定して設定します。

ステップサイズを2ポイント5マイクロメートルに設定し、組織の上から下への一連の画像を含む共焦点画像ファイルを収集します。次に、100%エタノールの20倍以上の容量を含むマイクロチューブに組織を移し、クリアリングを逆転させます。次に、1時間間隔ごとに、70に交換し、次に50%エタノールに交換し、最後にリン酸緩衝生理食塩水に交換します。

暗所で4°Cで保管し、埋め込むまで保管してください。ここでは、胎盤血管網を示すために、ヒト胎盤の顕微鏡画像と共焦点顕微鏡画像の両方を取得しました。これらの胎盤の顕微鏡画像は、胎盤実質を貫通した放射状の絨毛樹を示しています。

これらの顕微鏡画像は、絨毛のクラスターで終わる絨毛樹の断片の遠位部分の存在を示しています。次に、絨毛の栄養膜層を示すために、絨毛樹の遠位部分を免疫標識した。画像では、外側の栄養膜層が緑色で、毛細血管が赤色で示されています。

次いで、透明化前後の胎盤組織を確認するため、未透明および透明化した胎盤組織の共焦点画像を取得した。この画像は、未透明の組織の場合、組織の100マイクロメートル以下の深さで免疫蛍光を捕捉できることを示しています。それどころか、透明な胎盤組織の場合、免疫蛍光ははるかに高い深さで捕捉できます。

また、従来の組織と逆透明切片とを比較し、透明組織をエタノールで逆処理して脱水した。透明化の前後に抗CK7を用いて胎盤組織を免疫組織化学的に染色したところ、清廉化による組織形態に大きな変化は見られませんでした。このアニメーションは、免疫染色された絨毛組織が組織体積の全深さに沿って分布していることを示しています。

手順に慣れたら、約18時間、3日間に分けてかかることが予想されます。この手順を実行しようとするときは、いくつかの異なるスキルセットが必要であることを覚えておくことが重要です。胎盤病理学、共焦点顕微鏡検査を行うことができる必要があります。

イメージングの3Dレンダリングを生成でき、免疫処理と分析に精通している必要があります。この手順に続いて、従来の組織学、STSページ、マルディなどの他の方法を実施できます。その開発により、この技術は、子癇前症、胎児の成長不良、胎児の苦痛の根底にある根本原因を探求するための母体胎児医学、新生児学、栄養膜生物学の分野への道を開きます。

このビデオを見た後、胎盤絨毛樹組織を除去、レンダリング、および分析する方法を十分に理解しているはずです。ビデオをご覧いただき、ありがとうございました。