In Vivoモデル システムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

この手順の全体的な目標は、発生のさまざまな段階にあるゼブラフィッシュの胚から全ゲノムDNA複製タイミングマップを生成することです。この方法は、胚発生中に発生するクロマチンの変化がDNA複製フォークの開始にどのように影響するかなど、細胞周期およびクロマチン生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、胚発生の定義された段階でin vivoで発生する複製変化をマッピングすることです。

この方法は、ゼブラフィッシュの発生中にDNA複製がどのように変化するかについての洞察を得ることができますが、他のシステムやモデル生物(チュニケート、カエル、ハエなど)にも適用できます。一般的に、この方法に不慣れな人は、ゼブラフィッシュの胚から単一細胞懸濁液を生成するためにある程度の練習が必要なため、苦労するかもしれません。胚が収集される前夜、ほぼ同数のオスとメスを使用して、数十匹の繁殖成体を繁殖タンクに入れます。

実験に応じて、次のいずれかの育種戦略を使用します。最初の繁殖戦略では、ゼブラフィッシュのオスとメスを数匹ずつそれぞれの飼育水槽に入れ、仕切りを使ってオスとメスを分離します。このアプローチを使用する場合は、多くの異なる繁殖タンクを設置し、それぞれから胚をプールして、生物学的多様性が集団を代表するようにします。

繁殖戦略その2は、数十匹のオスとメスのゼブラフィッシュを大きな飼育水槽に組み合わせることです。この戦略は、十分な数の胚がある限り使用してください。彼らがさまざまな創設者から来たため、遺伝的に人口を代表していると考えるのが妥当です。

時間指定の交配を行うには、朝の光サイクルが始まるとすぐに開始します。魚を浅瀬で10分間繁殖させ、胚が逃げるための偽の底を付けます。10分後、ストレーナーに胚を注ぎ、ウォッシュボトルを使用して10センチメートルのプレートにすすぎます。

同時に採取したすべての胚をプールし、採取時に印をつけて、すぐに摂氏28.5度のインキュベーターに入れます。同期的に発生する胚を確実に収集するには、胚のバッチを10分ごとに収集することが重要です。これは、胚発生の最も初期の段階で特に重要です。

日に1組の交配ペアから数百の胚が生まれることが予想されます。得られた胚の数が20未満になるまで、成虫を10分周期で繁殖させます。採取後約1時間から1.5時間後に、胚を選別し、インキュベーターから取り出し、解剖顕微鏡で観察し、死卵や未受精卵を選別します。

胚を数え、10cmプレートあたり100個の胚の密度で配置します。新鮮なE3培地を加え、胚を摂氏28.5度のインキュベーターに戻します。胚が所望の発生段階に到達したら、ゼブラフィッシュの胚発生段階に従って、光学顕微鏡で形態学的に段階を確認します。

胚が48 hpf以下の場合は、最大1500個の段階的胚を15ミリリットルの円錐管に移し、E3を使用して数回洗浄します。100個の胚ごとに、1ミリリットルのE3と20マイクロリットルのプロナーゼ溶液を追加し、穏やかに渦巻きます。最大1500個の胚を15ミリリットルのE3を含む1本のチューブでデコリオネーションすることができます。チューブを横向きに置き、胚を均一な層に配置して、表面と体積の比率を最大化します。

すべての絨毛膜が胚から落ちるまで、2〜3分ごとにチューブを静かに攪拌します。総デコレーション時間は、プロナーゼの活動によって異なります。.上清を取り除き、10ミリリットルのE3で胚を3回穏やかにすすいでください。

胚を氷の上に置いて残りのE3を取り除いた後、500個の胚ごとに1ミリリットルの調製したばかりの氷冷脱ヨールク緩衝液を使用してサンプルを洗浄します。次に、P1000を使用して、胚を5〜10回ゆっくりと上下にピペットで動かし、卵黄の袋を破壊します。その後、1ミリリットルを1.5ミリリットルのマイクロチューブに移し、4°C、500倍の重力で5分間遠心分離します。

サンプルは、細胞を溶解せずに単一細胞懸濁液を作成するのに十分なだけ激しくピペットで移動する必要があります。このステップには、ある程度の練習が必要です。上清を取り除き、氷冷した1x PBSの1ミリリットルを使用してペレットを洗浄し、リンガー溶液を取り除きます。

その後、サンプルを再度遠心分離します。上清を慎重に取り除き、細胞を1×PBSの1ミリリットルに再懸濁します。次に、チューブを氷の上に置きます。

15ミリリットルの円錐管に3ミリリットルの氷冷エタノールを加え、EtOHのチューブを低い設定で穏やかにボルテックスします。P1000を使用して、ゼブラフィッシュの胚細胞懸濁液をゆっくりとEtOHに滴下し、ボルテックスを続けます。合計1ミリリットルの胚細胞懸濁液を添加し、75%EtOHの最終固定溶液を得ます。

1ミリリットルの細胞懸濁液を加えた後、チューブを静かに攪拌して混合し、マイナス20°Cで少なくとも1時間横向きに置くか、懸濁液を冷凍庫で2〜3週間保存します。胚性DNAを染色するには、マイナス20°CからEtOH固定胚細胞を取り除いた後、重力1500倍、摂氏4°Cでチューブを5分間遠心分離します。チューブを氷の上に置き、上清を慎重に取り除きます。

次に、P1000を使用して、調製したばかりの冷たいPBS-BSAの1ミリリットルに細胞を穏やかに再懸濁します。細胞を重力1500倍、摂氏4度で5分間遠心分離し、サンプルを氷上に置きます。次に、上清を取り除き、1, 000個の胚ごとに、200マイクロリットルのヨウ化プロピジウム染色溶液を加えて細胞を再懸濁します。

細胞をPI溶液で氷上で30分間インキュベートし、5分ごとに穏やかに混合します。40 μmのナイロン製セルストレーナーを、氷上の50 mmLの円錐形チューブの上に置きます。次に、細胞を静かにピペットで動かして、メッシュを通して細胞溶液を混合し、ろ過します。

シリンジプランジャーの平らな内側の端を使用して、メッシュ上に残っている細胞の塊を穏やかに破壊します。1, 000個の胚ごとに、500マイクロリットルの冷たいPBS-BSAを使用して、フィルターを通して細胞をすすぎます。氷上の15ミリリットルの円錐管の上に40マイクロメートルのメッシュを置き、50ミリリットルの円錐管からの細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブにもう一度ろ過します。

最後に、適切な細胞選別装置を使用して、レーザー励起を561ナノメートルに設定し、発光検出を610オーバー20に設定して、ヨウ化プロピジウムを検出します。セルをソートし、テキストプロトコルに従って追加の分析を実行します。リードマッピングの品質を判断するには、まず、mapQ 値の統計を使用して、シーケンシングデータをゲノムにアラインメントする必要があります。

さらに、計算された読み取り長統計は、すべてのシーケンシング読み取りの挿入サイズの分布のヒストグラムとしてプロットされます。この実験では、中央値が170bpでした。この棒グラフは、マッピングされたリードの合計、低品質フラグを含むリード、異なる染色体にマッピングされたペアを持つリード、距離しきい値を超えるペアを持つリード、および PCR 重複の読み取り統計を示しています。

ここには、ゼブラフィッシュサンプルの一般的なシーケンシングランにおけるマッピング済み、マッピングなし、およびペアになっていないリードの合計、カバレッジ、およびリード解像度の代表的な数がリストされています。フィルタリング後、読み取りカウントは可変サイズのウィンドウで決定され、データは平滑化および正規化されます。ここでは、代表的なゼブラフィッシュ染色体の生物学的複製のための典型的な平滑化および正規化された複製タイミングプロファイルを示します。

生物学的反復と実験的反復のプロファイルは非常に類似している必要があり、染色体の長さに沿って高い相関も示しています。また、プロファイルは、ゲノム全体のタイミング値間で高い相関関係を示す必要があります。カラーマップはピアソンの相関係数を表します。

この手順を試行する際には、同期的に発生する胚が収集されていることを確認することを覚えておくことが最も重要です。この手順に続いて、モルフォリノ注射やCRISPR-Cas9突然変異誘発などの他の方法を実行して、DNA複製が他の発生プロセスと協調するメカニズムは何かなどの追加の質問に答えることができますか?このビデオを見れば、同期発生中のゼブラフィッシュ胚から細胞周期の特定の段階で細胞を採取する方法を十分に理解できるはずです。

これらのサンプルを収集することは、全ゲノムDNA複製タイミングマップを生成するために重要です。