制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

この実験の全体的な目標は、光遺伝学的制御と遺伝子発現のライブモニタリングにより、振動情報の細胞間移動を観察することです。この方法は、Notchシグナル伝達経路を介して細胞が互いにどのように通信するか、特に細胞が振動情報を互いに伝達する方法に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、遺伝子発現動態を非常に高い精度で制御および監視できることです。

その手順を実演するのは、この新技術を開発した私の研究室の研究員である磯村明弘です。Tol2ベースの光遺伝学的モジュールのプラスミドベクターをトランスポゼース発現ベクターとともにC2C12細胞にトランスフェクションするには、まずトリプシン化した細胞をセルカウンターでカウントします。トランスフェクションの1日前に、1ウェルあたり50, 000個のC2C12細胞を12ウェルプレートにプレートします。

次に、0.375マイクログラムのTol2ベースの光遺伝ベクター、0.125マイクログラムの薬物選択ベクター、および0.5マイクログラムのトランスポゼース発現ベクターをリポフェクション試薬を使用して同時トランスフェクションします。トランスフェクションした細胞をトリプシン化し、トランスフェクションの1日後に100mm培養皿にプレートします。トランスフェクションした細胞の培地を、100ミリグラム/ミリリットルのハイグロマイシンを添加した培地に交換します。

細胞を3日間培養して、トランスフェクションされていない細胞を排除します。なお、媒体の変更は不要です。次に、トランスフェクションされた細胞をトリプシン化し、テキストプロトコルに詳述されているように、レシーバー細胞と光感受性細胞を選別することにより、選択のために蛍光タンパク質を発現する細胞の集団を精製します。

光源付きと光源なしの2種類のインキュベーターを設置し、光誘起状態と暗所状態に対応します。照度計を使用して、青色LEDトランスイルミネーターの光強度を設定します。ドアを閉めた後の光量を測定します。

制御スクリプトをシングルボード・マイクロコントローラにロードして、照明のスケジュールをプログラム可能なものにすることで、光の照明のタイミングと時間をプログラムできます。トリプシン処理された細胞をセルカウンターで数え、直径35ミリメートルのプラスチック培養皿にpAI218とpAI170を運ぶ100、000枚の感光性送信者細胞をプレートします。暗い条件と明るい条件のために別々のインキュベーターに皿を置きます。

ディッシュを設置した後、細胞が溶解物を収集するまで、インキュベーターのドアを閉めたままにしてください。めっきから1日半後、照明点灯開始。望ましくない光刺激を避けるために、細胞を制御されていない光にさらさないでください。

したがって、ドアを開けずにこの手順を実行してください。ここでドアを開けるのはデモンストレーションのためだけであることに注意してください。めっき後約2日後、インキュベーターから30分間隔でサンプル皿を氷に移し、さらなる分析のための細胞溶解物の調製を開始します。

PMTによる光刺激に対する細胞応答をリアルタイムにモニタリングするためには、まず標準的な方法で送信細胞と受信細胞の数をトリプシンしてカウントします。25, 000 個のレシーバーと 125, 000 個のセンダーセルの 1 ミリリットルの総容量懸濁液を準備します。24ウェルブラックプレートの各ウェルに混合細胞を1ミリモルルシフェリンを含む培地でプレート化します。

プレートリーダーでルシフェラーゼアッセイ用の細胞を解析し、出力シグナルが記録システムに対して高すぎないことを確認します。次に、プレートを録音システムにセットし、録音プログラムを開始します。たとえば、録画を設定してから18時間後にライト照明を開始します。

光遺伝学的摂動の制御下での単一細胞応答のリアルタイムイメージングのために、最初に50, 000レシーバーと250, 000の送信者細胞を直径27ミリメートルのガラスベース35ミリメートルの皿にプレートします。混合比と総セル数が正しく調整されていることを確認してください。めっきの1日後、記録媒体の2ミリリットルと媒体を交換します。

ガラスベース皿を、摂氏37度、二酸化炭素5%の環境チャンバーを備えた倒立顕微鏡にセットします。冷却されたCCDカメラをセットアップします。CCDセンサーの温度が目的地の値まで冷却されていることを確認してください。

自動取得ソフトウェアで多次元タイムラプスウィンドウのパラメータを設定し、5分間隔で288回以上の画像をキャプチャします。多次元タイムラプスウィンドウで、発光チャネルを選択します。読み出しモードが、弱く発光する生物発光を検出するための読み出しノイズを減らすために重要な低速50キロヘルツ読み出しモードに設定されていることを確認します。

多次元タイムラプスウィンドウで、蛍光チャンネルを選択します。読み出しモードが高速1メガヘルツモードに設定されていることを確認して、蛍光イメージングに必要な時間を短縮します。最後に、400ミリ秒の露出で2×2のビニングを設定します。

次に、ジャーナルタブを選択して、定期的なブルーライト照明で細胞を刺激するスケジュールを設定します。プラス ボタンをクリックして、新しい仕訳設定を追加します。ジャーナルボックスからジャーナルファイルを選択し、複数のタイムポイントを選択し、初期ポイントボックスとインターバルボックスに値を設定して、刺激をスケジュールします。

指定されたジャーナル・ファイルに、照明、シャッターの開き、遅延、シャッターの閉、および遅延を選択するためのシーケンシャル・プロトコルが含まれていることを確認してください。次に、定期的なブルーライト照明で細胞を刺激するスケジュールを設定します。最後に、 取得 ボタン。

最後に、テキストプロトコルに記載されているように、タイムラプス動画から発光チャネルの単一細胞トレースを抽出します。オプトジェネティックな送信者-受信者アッセイの代表的な結果を以下に示します。光誘導性送信者細胞は、予想通り、周期的な青色光照射の存在下でデルタリガンド発現の振動パターンを産生しました。

レシーバー細胞を光感受性センダー細胞と共培養し、反復光照明に曝露すると、リアルタイムの生物発光記録システムが、さまざまな混合比の条件下でレシーバー細胞の周期的な応答を検出します。さらに、反復光照明によるタイムラプス顕微鏡法では、単一細胞レベルでの受信者細胞の同期応答も明らかになります。その開発後、この技術は、細胞生物学の分野の研究者が、遺伝子発現の動的情報が細胞間相互作用でどのように伝達されるかを探求する道を開きました。