発芽アッセイ回転楕円体を使用して推定される芽新生体外パフォーマンスを評価する包括的な手順

この実験の全体的な目標は、in vitro のスフェロイド発芽アッセイを使用して、推定される血管芽腫の血管新生術の性能を評価することです。この方法は、腫瘍血管新生などの血管新生分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、古典的な腫瘍血管新生が血管芽腫に存在し、それが血管芽腫で増殖するin vitroを評価するための包括的な手順の産物であることです。

この技術の意味は、血管芽腫および血管系の治療にまで及びます。なぜなら、その結果は血管芽腫の血管新生の複雑さを強調しており、この一般的な形態の血管新生は補完的なメカニズムにすぎないことを示唆しています。したがって、この方法は、血管芽腫または血管新生の研究への洞察を提供することができます。また、ガラス腫瘍における腫瘍血管新生模倣など、一部の固形腫瘍における腫瘍、血管新生、および血管新生に関連するアプリケーションにも適用できます。

これらの操作された内皮細胞スフェロイドステップの生成を学ぶのが難しいため、この方法の実際のデモンストレーションは非常に重要です。なぜなら、適切なコンディションが重要だからです。まず、10%のウシ胎児血清、ペニシリン、およびストレプトマイシンを添加したDMEM培養培地でHUVEC内皮細胞を培養します。

次に、インキュベーター内の培養物を摂氏37度に維持し、二酸化炭素を5%にします。次に、shRNAフラグメントを合成するために、ApaIおよびEcoRI制限酵素でプラスミドを消化します。次に、消化したプラスミドに、フォワードオリゴとリバースオリゴの両方、10x NEBバッファー、および二重蒸留水を加えて、最終容量50マイクロリットルにします。

すべての試薬を加えた後、混合物を摂氏98度で4分間加熱します。その後、数時間で徐々に室温まで冷まします。T4リガーゼを使用して、アニーリングされたオリゴとプラスミドをライゲーションします。

チューブを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、25マイクロリットルのDH5alphaコンピテントセルに5マイクロリットルのライゲーションミックスを加えます。500マイクロリットルのDMEM培地に、レンチウイルスベクターまたはスクランブルベクターを他のパッケージングプラスミドとともに添加します。

次に、レンチウイルス混合物を摂氏37度で25分間インキュベートします。インキュベーション後、スクランブルまたはレンチウイルス混合溶液に7ミリリットルのDMEM培地を加えます。293FT細胞を、ウシ胎児血清を含まないDMEM培地で10cmの培養皿で培養します。

1ミリリットルのレンチウイルス溶液またはスクランブル溶液を培養皿中の293FT細胞に加えます。6時間後、培養皿から古い培地を吸引します。次に、古い培地を10%のウシ胎児血清を含む新しいDMEM培地に交換します。

48時間後、培地を回収します。HUVEC内皮細胞をレンチウイルス培地に移し、72時間維持します。次に、ピューロマイシン1ミリリットルあたり2マイクログラムをHUVEC細胞培養培地に加えます。

最後に、培養物をさらに24時間インキュベートします。翌日、1ミリリットルのトリプシンEDTAを加えてHUVEC細胞をトリプシン化します。次に、トリプシン化した細胞懸濁液をDMEM培地に10%ウシ胎児血清とともに再懸濁します。

セルカウンターを使用してセルの数をカウントします。カウント後、3D丸底96ウェルプレートに細胞を播種します。播種後、細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素と72時間連続してインキュベートします。

36時間後、培地の半分を新鮮な培地と交換します。まず、ゲル溶液を摂氏4度で解凍し、次に還元血清培地で1対5の比率で希釈します。マイクロピペットを使用してDMEM培地からスフェロイドを吸引します。

次に、スフェロイドを5ミリリットルの還元血清培地で洗浄します。懸濁したスフェロイドと希釈したゲルを慎重に移します。15ウェルプレートに、スフェロイドと希釈ゲルの混合液を300マイクロリットルに埋め込みます。

プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%で1時間インキュベートします。次に、400マイクロリットルの還元血清培地を1つのウェルに加えます。蒸発を防ぐために、井戸の周囲を滅菌水で満たします。

次に、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度100%で1時間培養します。インキュベーション後、古い培地を吸引し、1%の内皮細胞増殖サプリメントを含む600マイクロリットルの還元血清培地をウェルに加え、1日間インキュベートします。倒立型光学顕微鏡を使用して画像をキャプチャします。

ここでは、細胞のスフェロイド発芽を倒立型光学顕微鏡を使用して捕捉し、VHL遺伝子サイレンシングが内皮細胞の血管新生能に及ぼす影響を研究します。スフェロイドは、レンチウイルス治療の12時間後に、対照細胞とVHLサイレンシング内皮細胞の両方で発芽することが見られます。次に、VHL遺伝子サイレンシングスフェロイドによって生成されたスプラウトの長さを定量化するための統計解析を行います。

平均芽の長さは、VHLサイレンサー群で約125マイクロメートルであるのに対し、対照群では約65マイクロメートルであるようです。VHLサイレンシング群の平均累積芽長は約1250マイクロメートルで、対照群の平均スプラウト長は約680マイクロメートルです。これらの結果は、VHLサイレンシング群でスプラウト長が2倍に増加したことを示している。

このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば48時間で習得できます。この手順およびキャピラリー形成アッセイのような方法に従って、追加の質問に答えるために実施することができる。血管内皮細胞の血管新生能力を探求するようなものです。

この開発の後、この技術は、血管新生の分野の研究者が腫瘍の内部血管形成を探求する道を開きました。このビデオを見れば、エクスプローディングアッセイに使用される操作された内皮細胞でどの遺伝子が機能を失うのかを十分に理解できるはずです。