高圧低温電子トモグラフィー法によるシアノ バクテリアの DNA 締固めの可視化
2018年7月17日
このプロトコルでは、シアノ バクテリアの一時的な DNA の締固めを可視化する方法について説明します。同期の栽培、蛍光顕微鏡、急速凍結、高によって監視電圧低温電子断層撮影法を使用します。これらの方法のためのプロトコルを提案し、, 将来のアプリケーションや開発を議論しました。
この方法は、細菌の細胞周期中にDNA構造がどのように変化するかなど、微生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、追加の処理なしで、適切な時点で生きた状態に近い全細菌細胞の超微細構造を視覚化できることです。その手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるChihong Songさんと、金子先生の研究室の大学院生である林真子さんです。
まず、1.5%の寒天と0.3%のチオ硫酸ナトリウムを含む9cmの滅菌BG-11プレートでシアノバクテリアを培養します。プレートを摂氏23度で12-12光サイクルでインキュベートし、1平方メートルあたり毎秒50μEの光でインキュベートします。細胞を維持するために、毎週新鮮なBG-11寒天プレートに細胞を移します。
1週間以内に、カルチャーは緑色の帯として表示されます。炎滅菌ループを使用して細胞の緑色の塊を移し、新しいプレートに縞模様にします。DNAの圧縮を観察するには、光期の終わりに6日間培養した細胞を採取します。
プレートから細胞を放出するには、0.2モルのスクロースを1ミリリットル加えます。次に、細胞懸濁液を回収し、溶液が緑色に変わるまでショ糖の添加と除去を繰り返します。色の変化は、ほとんどのセルが解放されたことを示しています。
次に、500マイクロリットルの懸濁細胞溶液をマイクロチューブに移し、ヘキスト染色剤を添加して、最終濃度を1ミリリットルあたり1マイクログラムにします。その後、細胞を暗闇で10分間インキュベートします。次に、細胞をスピンダウンし、上清を捨てて、10マイクロリットルの0.2モルスクロースに再懸濁します。
次に、懸濁液1マイクロリットルをスライドガラスに移し、カバースリップを装着し、UVフィルターを装着した蛍光顕微鏡で細胞を観察します。100倍の油浸対物レンズを使用して、ほとんどの細胞で観察できるDNA圧縮の証拠を探します。まず、プランジ凍結装置を準備します。
次に、エタン容器と冷却ロッドアタッチメントを挿入して液体窒素容器をセットします。次に、容器に液体窒素を入れ、液体窒素温度まで冷却します。その後、エタンガスをコンテナにロードします。
液体エタンは爆発性があるため、必ず安全メガネを着用してください。最後に、冷却ロッドのアタッチメントを取り外し、霜が付着しないように容器をプラスチック製の蓋で覆います。次に、カーボンコーティングされたEMグリッドのカーボン側を、プラズマイオンバリアを使用して50ミリアンペアで30秒間グロー放電します。
次に、テストプロトコルに従ってVitrobotを準備します。ピンセットを使用して、前処理されたEMグリッドをチャンバーにセットします。EMグリッドを1マイクロリットル、15ナノメートルのBSA金トレーサーで処理し、サンプルを塗布する前に基準マーカーとして使用します。
次に、2.5マイクロリットルの細胞懸濁液をグリッドに分注します。濾紙を使用して余分な溶液を拭き取り、すぐにグリッドを液体エタンで凍結します。凍結したグリッドは、検査できるようになるまで液体窒素で保管してください。
次に、HVEMを起動し、1メガボルトの高電圧に設定します。次に、液体窒素を使用して試料グリッドホルダーをマイナス150°Cに冷却します。冷却したら、凍結したグリッドを冷却したクライオ試料ホルダーに取り付け、HVEMにロードします。
セットアップが氷で汚染されないように注意してください。次に、1, 000 倍の低倍率でイメージング領域を選択します。次に、ユーセントリックZ軸の高さを調整し、試料ステージをマイナス60度に傾けます。
次に、傾斜回転のバックラッシを取り除きます。次に、10, 000倍の倍率でターゲット位置の近くに焦点を合わせます。ピントの合った画像からの偏差により、6〜10ミクロンのアンダーフォーカスを設定します。
イメージングでは、線量を 2 電子/平方オングストローム/秒以下に設定します。電流密度で反射される電子線量に注意し、デジタルカメラや電子膜で撮影します。次に、負の 60 度から正の 60 度までの傾斜画像を 2 度から 4 度刻みで収集します。
可能であれば、顕微鏡の自動機能を使用してください。商用ソフトウェアパッケージを開き、断層撮影再構成用の傾斜画像をロードします。次に、コマンド tif2mrc または newstack を使用して、個々のイメージからイメージ・スタック・ファイルを作成します。
次に、eTomo GUIソフトウェアを起動し、ピクセルサイズ、基準直径、画像の回転などの画像パラメータを入力します。したがって、編集スクリプトを作成します。次に、推奨ソフトウェアを使用して、基準マーカーを使用して位置合わせされ、平均残差誤差が 0.5 未満の傾斜シリーズを作成します。
最後に、SIRT アルゴリズムを使用して 3D 断層撮影を再構築します。次に、断層撮影から関心領域を抽出し、異方性拡散フィルター、両側フィルター、数学的形態フィルターなどのノイズ除去フィルターを適用します。画像のコントラストを強化するパラメーターを使用してフィルタリングを実行します。
次に、関心のあるフィーチャをセグメント化します。スライス機能を使用して断層撮影を開きます。次に、セグメンテーションエディタウィンドウに移動し、新しいラベルフィールドを選択してセグメンテーションファイルを作成します。
次に、最初のスライスで目的のフィーチャの境界を手動でトレースし、次に他の各スライスでトレースします。関心のある追加機能は、同じ操作を使用して追加できます。次に、SurfaceGen メニューのオプションを使用してセグメント化されたボリュームを視覚化するサーフェス レンダリングを生成するには、SurfaceView メニューを選択します。
3D ボリュームを移動、回転、ズームインするには、3D Viewer ウィンドウのツールを使用します。自動セグメンテーションは、Magic Wand Toolを使用して実行できます。オブジェクトをクリックし、[表示] と [マスキング] のスライダーを調整して、オブジェクトの機能が完全に選択
されるようにします。精密な同期培養では、Hoechstで標識されたDNAは、暗所では正常な均一な分布を示し、その後、光期中に細胞内で徐々に圧縮し、光期の終わりまでに波状の棒状構造を帯びます。最後に、ロッドは中央で分裂し、その2つの部分は娘細胞に分配されます。細胞分裂後、圧縮されたDNAはすぐに消え、DNAは正常な均一な分布に戻ります。
DNA圧縮の最終段階にある細胞を凍結し、高電圧電子顕微鏡で観察したところ、多くの細胞が正常細胞と容易に区別できる明確なDNA圧縮を示しました。一部は、細胞分裂前に予想されたように、細胞の中心に狭窄を示しました。3D断層撮影から、コンパクトなDNAは細胞質内で目に見えて分離され、低密度の材料に囲まれています。
チラコイド膜層は、圧縮されたDNAの波状ロッドに沿って歪んでいます。興味深いことに、多くの小さなリン酸塩体が圧縮されたDNAに付着し、通常はペアで現れます。これらのポリリン酸体は、DNA合成のためのリン酸塩の供給者であり得る。
このビデオを見れば、染色などの追加処理を一切行わずに、クライオ高電圧電子顕微鏡により、適切な時点での生存状態に近い全細菌細胞の超微細構造を可視化する方法を十分に理解できるはずです。この手順を試みる際には、光サイクルの終わりにDNAの圧縮状態が毎分変化することを覚えておくことが重要です。サンプルを凍結するのに最適なタイミングを見逃さないようにしてください。
この手順に続いて、圧縮されたDNA中の特定のタンパク質またはヌクレオチドの局在に関する追加の質問に答えるために、CLEMなどの他の方法を実行できます。この手法は、開発後、微生物学の分野の研究者が、細菌や小さな真核生物における細胞分裂、DNA分離、ウイルス感染を探求する道を開くはずです。
概要
本プロトコルでは、蛍光顕微鏡およびクライオ電子トモグラフィーを用いて、シアノバクテリアにおける一過性のDNA凝縮を可視化する方法について解説します。本研究では、イメージングに向けたシアノバクテリア細胞の培養および調製手順について述べ、細胞周期におけるDNA構造変化を観察することの重要性を強調しています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 微生物学
- 細胞生物学
- 構造生物学
背景
- DNAの凝縮を理解することは、細菌の細胞周期に関する知見を得るために極めて重要です。
- 蛍光顕微鏡を用いることで、細胞内プロセスのリアルタイム観察が可能になります。
- クライオ電子トモグラフィーは、細胞の超微細構造の高解像度イメージングを可能にします。
- この手法により、追加の処理を行うことなく、生体に近い状態で可視化することができます。
研究目的
- 細胞周期におけるシアノバクテリアのDNA凝縮を可視化する。
- 蛍光顕微鏡法およびクライオ電子トモグラフィーを用いるためのプロトコルを開発する。
- このイメージング技術の今後の応用について考察する。
使用された手法
- BG-11寒天培地でのシアノバクテリアの培養。
- DNA凝縮を観察するためのHoechst染色を用いた蛍光顕微鏡観察。
- クライオ電子トモグラフィーのための試料の急速凍結。
- 細胞構造を解析するためのトモグラムの3D再構成。
主な結果
- Hoechstでラベル化したDNAは、暗所において均一に分布している。
- 明期の間、DNAは徐々に凝縮し、波状の棒状構造となる。
- 凝縮したDNAは分裂し、娘細胞へと分配される。
- 高解像度イメージングにより、詳細な細胞超微構造が明らかになる。
結論
- この手法により、シアノバクテリアにおけるDNA凝縮を効果的に可視化できます。
- これにより、細菌の細胞周期のダイナミクスに関する知見が得られます。
- 本プロトコルは、微生物学におけるさまざまな用途に適応させることが可能です。
よくある質問
産業上の重要性
本プロトコルでは、細胞分裂に関連する動的なプロセスであるシアノバクテリアにおける一過性のDNA凝縮の可視化を可能にします。蛍光モニタリングと高電圧クライオ電子トモグラフィーを組み合わせることで、近自然状態における短寿命の細胞内イベントを捉え、解明するための再現可能なワークフローを提供します。このアプローチは、細菌の染色体分離の構造動態を明らかにすることで、抗菌薬ターゲットバリデーションにおけるメカニズム的なリスク低減を支援します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：細菌の細胞周期におけるDNA構造ダイナミクスの解析を可能にし、染色体分離機構のターゲットバリデーションを支援する。
- 実用的価値：機能的な蛍光シグナルを超微細構造のコンテキストと関連付けるための、相関光電子顕微鏡法（CLEM）互換のワークフローを提供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 時間分解イメージング用の同期させた細菌培養の調製を容易にし、化合物誘発性の構造摂動を解析するためのアッセイ準備済みシステムを可能にします。
- 運用的価値： スクローズを用いた放出とHoechst染色による試料調製を標準化し、さまざまな顕微鏡プラットフォームにおける再現性を向上させます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： DNA-タンパク質相互作用および凝縮過程における膜のリモデリングを可視化し、細胞分裂の忠実度に関連するトランスレーショナルなバイオマーカーの探索に寄与する。
- 運用的価値： DNAダイナミクスに対する遺伝学的または化学的な摂動を評価するプラットフォームを提供し、基礎研究から前臨床試験への継続性を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期生物学における仮説検証からリード最適化におけるメカニズムの検証に至る発見の連続的なプロセスに適合しており、特に細菌の細胞周期調節に関与するターゲットに有用である。
- 基礎生物学：DNA凝縮ダイナミクスの直接観察を可能にし、細胞周期調節因子や構造タンパク質の仮説検証を支援します。
- スクリーニング：ハイコンテンツイメージングや化合物スクリーニングアッセイに適した、同期化され蛍光能を持つ細胞を調製します。
- 解析：定量的な3Dトモグラムとセグメンテーションデータを生成し、DNA構造、膜の歪み、およびリン酸体の会合に関する形態学的解析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：観察されたDNA凝縮の表現型を、分裂の忠実度などの下流の表現型に結びつけ、前臨床モデルにおけるバイオマーカーの整合性を支援します。
- 汎用的利用：ファージ感染、隔壁形成、またはプラスミド分離などの一過性の細菌構造を調査するための、再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：天然状態のDNA構造とその経時的変化を可視化することで、標的メカニズムにおける予測の信頼性を高めます。
- 運用の価値：標準化された同期、染色、および凍結固定プロトコルを通じて、再現性を向上させます。
- 戦略的価値：標的結合効果の直接的な構造的根拠を提供することにより、抗生物質標的のバリデーションにおける生物学的なリスク低減の不確実性を減少させます。
- ポートフォリオへの影響：必須の細胞プロセスに関連する超微形態的表現型に基づいた、データ駆動型のgo/no-go決定を可能にします。
実施上の検討事項
- 微生物培養の同期化、蛍光顕微鏡法、およびクライオ電子トモグラフィー装置に関する専門知識。
- 1 MVでの動作およびクライオ試料処理が可能な高電圧電子顕微鏡（HVEM）へのアクセス。
- 一過性のイベントを捉えるための、ラボ間での蛍光タイミングおよび凍結プロトコルの標準化。
- 細胞サイズ、細胞壁構造、またはDNAダイナミクスが異なる他の細菌種への適用に関する検討事項。
- 実用上の制限として、正確なタイミングを必要とするDNA凝集の一過的な性質、および特殊なHVEMインフラストラクチャの必要性が挙げられる。
バイオファーマに関するよくあるご質問
Chapters in this video
0:04
Title
0:43
Synchronous Culture of Cyanobacteria and Monitoring by Fluorescence Microscopy
2:31
Sample Freezing and Cryo-HVET
5:16
Tomographic Reconstruction and Segmentation of the Feature of Interest
7:20
Results: Observations of Compacted DNA in Cyanobacteria
8:36
Conclusion
