放線菌突然変異体のビジュアルと顕微鏡的評価

以下の技術の全体的な目標は、大学の教育研究室や高校の教室でストレプトマイセスや他の関連種を扱うための初心者研究者を訓練することです。表現型の観察は、Streptomyces研究の分野に参入する多くの研究者にとって重要です。このビデオでは、細菌の増殖、保存、目視および顕微鏡検査の方法について説明しています。

ここで説明する表現型法は、Streptomyces coelicolorをモデルとして用います。ただし、この方法は、大型属のすべてのメンバーだけでなく、密接に関連する放線菌にも適用できます。これらの手法の主な利点は、高校の教室や学部の教育研究室の初心者研究者だけでなく、経験豊富な研究室の担当者もアクセスできるように設計されていることです。

このビデオを見て、付属のプロトコルを読んだ後、新しい研究者はStreptomyces株を操作し、適切に保存して、視覚的特性評価実験を開始できるはずです。手順を実演するのは、オッターバイン大学の私の研究室の学部生であるGarret KandellとSean Kirkです。まず、Saunders 2012で実証された象限ストリーク法などの標準的な方法を使用して、Streptomyces株をMS寒天プレートにストリークし、培養を単一のコロニーにします。

4〜6日ごとに、1つのコロニーを選び、それを新しいプレートに再度縞模様にします。コロニーが老化すると、ランダムな突然変異を起こしやすくなります。テキストプロトコルに従って突然変異誘発を行った後、野生型の親株と比較した各変異体のコロニー形態に注意してください。

新しいStreptomyces種を特徴付けるときは、新しい分離株をよく研究された種の分離株と比較し、基本的な形状、コロニーの表面、不透明度、隆起、および色素沈着に注意してください。MS寒天プレートを標識し、野生型および変異株をウェッジパターンで線条状にします。クロスコンタミネーションを避けるために、ひずみが他のひずみに触れないように注意してください。

プレートにひずみが縞模様になっている日時に注意してください。次に、プレートを摂氏30度でインキュベートします。Streptomycesサンプルを汚染から常に保護することが非常に重要であることを忘れないでください。

すべてのステップで最高の滅菌技術を使用し、プレートとチューブを可能な限り短い時間で開きます。成長したペトリ皿を色紙または白い紙に置き、背景を均質化します。紙に菌株名、日付、インキュベーション温度、および最初のプレートストリーキングからの時間を書きます。

紙の背景にひずみ情報を書いたプレートのデジタル写真を撮り、混乱を最小限に抑えます。ピンセットを70%エタノールで洗浄し、ブンゼンバーナーの炎に通してエタノールを蒸発させて滅菌します。カバースリップを70%エタノールで洗浄し、滅菌済みのペトリ皿で乾燥

次に、細菌増殖のカバースリップリフトを準備するには、滅菌ピンセットを使用して滅菌カバースリップをピックアップし、細菌の増殖が密集しているMS寒天プレートにカバースリップを置きます。ピンセットを使用して、カバーガラスの裏側をそっと押して、細菌の胞子と空中菌糸体が十分に移動するようにします。プレートからカバースリップを拾い上げ、細胞材料を50%グリセロールの15マイクロリットル滴を含む顕微鏡スライドの表面に向けて45度の角度で置きます。

カバーガラスをグリセロールに落とすと、気泡が減少します。位相差顕微鏡をさまざまな時間間隔で行うには、準備したスライドを顕微鏡ステージに置き、カバーガラスの中央に液浸油を一滴加えます。100xフェーズ目標を所定の位置で回転させ、コンデンサータレットを適切なマッチングフェーズ設定に設定します。

対物レンズがオイルに接触したら、微調整ノブのみを使用して画像の焦点を合わせます。いくつかの視野を調べて、変異株と野生型との間の顕著で一貫した違いを識別します。胞子を形成する能力、胞子のサイズと形状、胞子の総数など。

滅菌ピンセットを使用して、細菌の増殖が明らかな場合と同様に、MS寒天プレートからカバースリップリフトを準備し、ピンセットでカバースリップの裏側にそっと触れて、細菌の胞子と空中フィラメントの十分な移動を確保します。プレートからカバースリップを拾い上げ、カードストックの上に置いて、セル材料のある面が上を向くようにして、カバースリップを簡単に操作できるようにします。氷冷したメタノールでカバーガラスを浸し、5分間放置します。

PBSを使用して、溶液を静かに分注して取り除き、カバーガラスを2回洗います。10マイクログラム/ミリリットルのヨウ化プロピジウム溶液の15マイクロリットル、またはWGA-FITCの1ミリリットルあたり10マイクログラムをスライドに加えます。カバーガラスを下向きにして蛍光染色の滴の上に置きます。

サンプルを暗い部屋または薄暗い部屋で15分間インキュベートします。蛍光染色剤および染色サンプルのストックは、光から保護する必要があります。研究者は、サンプルを準備するときは暗い場所を使用し、サンプルが準備されたら暗いボックスを使用してサンプルを保持することをお勧めします。

位相差顕微鏡またはヨウ化プロピジウムおよびFITC用の落射蛍光励起キューブを装備したDIC顕微鏡を使用して、100倍対物レンズの下でスライドを観察します。テキストプロトコルに従って画像を分析します。ここに示されているのは、トランスポゾン突然変異誘発に起因するStreptomyces変異体の例です。

明るい色の空中菌糸体は、胞子形成の欠陥によって引き起こされる灰色の色素のレベルが低いことを示している可能性があります。または、ぼやけた外観の欠如は、空中菌糸体形成のブロックを示しています。位相差顕微鏡で見られるように、野生型S.coelicolorコロニーは、通常、約2日の成長で空中菌糸体を生成します。

そして、成長の3日で胞子の長い鎖。白色変異体は、胞子形成が遅れるか、産生される胞子の量が減少するか、形状および/またはサイズの欠陥を有する胞子を生成するか、または単に成熟した灰色の胞子色素を低レベルで産生する可能性があります。DICおよび蛍光顕微鏡とPI染色を用いたところ、野生型サンプル中の胞子鎖の等間隔染色を、染色体分離欠損を示す2つのトランスポゾン挿入変異体の間欠染色パターンと比較しています。

WGA-FITCを使用して細胞壁を染色すると、野生型株S.venezuelaeは胞子の鎖の間に滑らかな空気フィラメントとして存在します。そして、胞子形成中に典型的に見られる分割中隔の配列のような外側を示します。糸状生物を扱うことは、よく知られている棒状の細菌を扱うこととは大きく異なります。

ここでのビデオプロトコルは、Streptomyces研究の分野に参入する真新しい研究者にとって重要なリソースとして役立つはずです。このビデオを見た後、Streptomyces種やその他の関連細菌の研究を開始する方法についてよく理解しているはずです。これらの最初の実験に続いて、Streptomyces株についてさらに学ぶために、研究室でさまざまな手法を使用することができます。

例えば、高度な技術には、タンパク質のタグ付けや、リアルタイムPCRやRNAシークなどの遺伝子発現解析などがあります。初期の表現型解析は、新しい株を同定して特徴付け、特定の遺伝子の典型的な役割を識別するために使用されます。これらの方法は、すでに大学の教育研究室で、さまざまなストレプトマイセス株を同定し、特徴付けるために使用されています。