モーター軸索ナビゲーションと光シート蛍光顕微鏡を用いたマウス胚における軸索分枝の定量化の可視化

このプロトコルの全体的な目標は、マウス胚のライトシート顕微鏡と画像解析ソフトウェアを使用して、運動ニューロンの軸索分枝パターンの定性的および定量的評価を可能にすることです。この方法は、複雑な運動と協調した運動ニューロンの発生を理解するのに役立ちます。この手法の主な利点は、運動ニューロンの軸索樹状化パターンをさまざまな角度から観察および画像化し、個々の神経を定量的に分析できることです。

その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるYa-Ping YenとEe Shan Liauです。この手順を開始するには、胚を24ウェルプレートに個別に固定し、新たに調製した4%パラホルムアルデヒドをPBS中のウェル1ミリリットルで摂氏4度でシェーカーで一晩固定します。翌日、固定胚を少なくとも3回、それぞれ5〜10分間、1ミリリットルの1X PBSで洗浄し、摂氏4度で一晩インキュベートします。

次に、各胚を0.5%PBSTの1ミリリットルで、シェーカーで摂氏4度で一晩透過化します。1X PBSで調製した10%FBSの1ミリリットルで各サンプルを4°Cで一晩シェーカーでブロックします。その後、各胚を1ミリリットルの抗GFP一次抗体と摂氏4度で72時間、絶えず振とうしながらインキュベートします。

一次抗体のインキュベーション後、各胚を0.5%PBST1ミリリットルで1ミリリットル、摂氏4度、シェーカーで1〜2日間洗浄します。その後、1ミリリットルの二次抗体を添加し、4°Cの暗闇で一晩、絶えず振とうしながらインキュベートします。翌日、各胚を0.5%PBSTの1ミリリットルで、摂氏4度のシェーカーで2〜3日間にわたって少なくとも3回洗浄します。

次に、各胚を屈折率1.49 ndの市販の清澄試薬で、室温で光から保護された1.5ミリリットルのチューブで一晩インキュベートします。5X/0.1 照明光学系と 5X/0.16 検出光学系を設定します。サンプルホルダーとサンプルキャピラリーを組み立てます。

サンプルチャンバーに清澄溶液を充填して調製します。胚をマウントするには、P200ピペットチップをキャピラリーの直径に合うように上部を切り取り、サンプル付着用の尖った部分を取り外して準備します。次に、ピペットチップの鈍い端を小さな炎で溶かします。

炎を消し、溶けた端に胚を垂直にすばやく取り付けます。ピペットチップの上部をサンプルキャピラリーに取り付け、準備したサンプルチャンバーを顕微鏡に入れます。イメージングソフトウェアを使用して、[Locate]タブの[Locate Capilery]を選択し、X、Y、Z軸を調整します。

次に、[Locate Sample]を選択し、0.6倍にズームして胚に焦点を合わせます。チャンバーバッファーをしばらくの間胚と平衡化させて、破片や気泡を取り除きます。画像取得の場合は、[Acquisition] タブで、Detective Objectives、Laser Blocking Filter、Beam Splitter、Cameras、Lasers などのライトパス パラメーターを定義します。

シャドウリダクションの[ピボットスキャン]チェックボックスをオンにします。次に、アクイジション設定、ビットベプスから16ビット、0.36〜0.7倍の範囲へのズーム、シングルサイトイルミネーションまたはデュアルサイトイルミネーションを定義します。[連続]をクリックし、[レーザー強度]、[露光時間]、[レーザー出力]、および[ライトシート位置]を設定します。

続いて、Stop を押して画像取得を終了します。透明なサンプルが最短の光路内に配置されていることを確認して、個々の運動神経の微細な樹状構造の画像を詳細に取得できるようにすることが重要です。多次元集録の場合は、最初と最後の画像のz位置を移動してZスタックを定義します。

「最適」をクリックして、スライス番号を設定します。次に、[実験の開始] をクリックして、選択した Z スタックを取得します。完了したら、画像をczi形式で保存します。

軸索の樹状化を定量化するには、想像解析ソフトウェアで画像ファイルを開きます。[ディスプレイ調整] ウィンドウを使用して画像の色、明るさ、コントラストを調整し、ローカル強度のコントラストに基づいてフィラメントを検出します。次に、「Add New Filaments」アイコンをクリックし、ドロップダウンメニューから「Autopath Algorithm」を選択します。

関心領域を選択し、スライスモードを使用して測定できる最大直径と最小直径の測定値を割り当てることにより、開始点とシード点を定義します。関心領域の端に始点を割り当てます。開始点を手動で追加または削除するには、最初にポインター モードを変更し、選択をナビゲートしてから、目的のポイントで Shift キーを押しながら右クリックします。

次に、シードポイントの手動しきい値を選択して、表示されているすべてのアーボライゼーションがマークされていることを確認します。次に、シードポイントを手動で追加または削除します。[切断されたセグメントを削除] ボックスをオンにし、開始点の周囲のシード ポイントを削除します。

その後、バックグラウンド減算のしきい値を調整し、プロセスを終了します。正確な定量化のためには、バックグラウンドアーチファクトを除去し、検出器の経路が真の軸索アーボリゼーションを反映していることを確認する必要があります。最後に、希望のスタイルと色を選択します。

[統計]タブで、[詳細]を選択し、フィラメント番号、樹状突起終点を使用して、運動軸索の樹状化の指標として運動神経終末を定量化します。次に、再構築した軸索の画像をtiffファイルとしてエクスポートします。LSFMは、マウス胚における運動軸索の樹状形成を詳細に3D可視化します。

運動ニューロンを上記のプロトコルに供し、トランスジェネニック発現GFPで標識する。軸索のアーボリゼーションをより詳細に画像化し、定量化を行うために、倍率を調整して、微細なアーボライズされたすべての構造を明らかにすることができます。最後に、個々の前肢神経の軸索枝形成パターンを画像解析ソフトウェアを使用して再構築できます。

ソフトウェアのオートパスアルゴリズムは、フィラメントをトレースし、軸索終末の総数を定量化します。このビデオを見れば、ライトシート蛍光顕微鏡を使用してマウス胚のサンプルを調製し、運動ニューロン軸索を画像化する方法について十分に理解できるはずです。また、MRSによって個々の運動神経の樹木形成パターンを定量的に評価する方法も知ることができます。