低酸素/再酸素化後心筋細胞におけるミトコンドリア膜電位を測定するためのフロー フローサイトメトリーを用いたアッセイ

この方法は、ミトコンドリア膜電位の細胞に対する低酸素/再酸素化の影響を測定するのに役立ち、薬剤が損傷から保護するかどうかを評価するために使用できます。このアッセイの主な利点は、それによって検出されるMMPがミトコンドリアサイズなどの要因の場合であることです。さらに、材料と輝きに対する要件が低くなっています。

6ウェルプレートに70%コンフルエントなヒト心筋細胞から始めます。リン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄した後、2ミリリットルの血清およびグルコースフリーDMEMに薬物またはビヒクルを追加します。5%CO2と95%の空気を含む細胞培養インキュベーターで、摂氏37度で30分間インキュベートします。

30分後、ヒト心筋細胞の皿を2.5リットルの気密性低酸素瓶に入れます。遊離酸素を除去する触媒と、媒体中の酸素張力を測定するためのアネロビックインジケーターを装備しています。ジャーを組織培養インキュベーターに入れます。

アエロビックインジケーターの色は、正常酸素環境では水色から低酸素状態では淡い白に変わります。ヒトの心筋細胞を再酸素化するには、6ウェルプレートを瓶から取り出し、インキュベーターの棚に2時間置きます。再酸素化に続いて、1ミリリットルの予熱したPBSで細胞をすすぎ、0.5ミリリットルの予熱した25%トリプシンをウェルの壁に沿って加えます。

すべてのヒト心筋細胞がほぼ剥離するまで、摂氏37度で約1分間インキュベートします。次に、トリプシンを中和するために、1ミリリットルのDMEM完全培地をウェルに加えます。細胞懸濁液を15ミリリットルの遠心チューブに移し、室温でGの500倍で3分間遠心分離することによりHCMをペレット

遠心分離後、ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引します。次に、5ミリリットルのヒト心臓筋細胞完全培地と5ミリリットルのJC-1ワーキング溶液を各チューブに加えます。HCMをピペッティングで上下させて再懸濁します。

蛍光インジケーターの漂白を防ぐためにチューブをアルミホイルで覆い、細胞を通常の状態で20分間インキュベートします。摂氏4度に予冷した遠心分離機でGの500倍で3分間遠心分離することにより、ヒト心筋細胞をペレット化した後、2ミリリットルの氷冷JC-1染色緩衝液で細胞を2回すすぎます。2回目のすすぎ後、ヒト心筋細胞を300マイクロリットルの氷冷染色緩衝液に再懸濁します。

そして、サンプルをそれぞれのサンプルチューブにろ過します。フローサイトメトリーで30分以内に細胞を解析します。フローサイトメーターを起動し、ソフトウェアが接続されていることを確認します。

流体スタートアップを実行します。ストリームを開始し、ブレークオフを設定します。フローサイトメトリーソフトウェアで2つのドットプロットウィンドウを開きます。

最初のドット プロットで、X 軸で前方散乱光を選択し、Y 軸で側面散乱光を選択します。セルの特性を、それぞれサイズと粒度で表します。Y 軸の PE 検出チャネルを選択します。

また、X軸のFITCは、細胞内のJC-1色素の蛍光強度を測定するために使用される2番目のドットプロットの対数スケールを使用します。アンロードをクリックしてチューブサポートアームを取り出し、JC-1で染色されていないヒト心筋細胞が入ったブランクサンプルチューブを配置します。[ロード]をクリックして、サポートアームを作業位置に戻します。

空白のサンプル管の懸濁液から粒子を収集するには、レコードをクリックします。そして、2番目のドットプロットでフローレセンスチャネルの電圧を調整します。最初のドットプロットでさらに分析するために、細胞集団をゲートします。

次に、ヒトの心筋細胞を解析します。各サンプルチューブの統計を表示し、赤色の粉塵強度の比率を緑色の粉塵強度の比率で割ることにより、各サンプルのMMPを計算します。低酸素症と再酸素化は、アネキシンPI比で測定される正常細胞と比較して、ヒト心筋細胞のアポトーシスを有意に誘導します。

心臓保護効果を持つ中国の伝統医学は、低酸素/再酸素化後のHCMのアポトーシスを予防しました。このように、ミトコンドリアCCPで処理した後のJC-1の赤/緑の比率はほぼゼロでした。アポトーシスアッセイの結果と一致しています。

H/R処理群は、正常群と比較して、赤/緑比が有意に低くなりました。そして、このような比率変更を逆転させました。この手順を試みる際には、温度がミトコンドリア膜電位の安定性に大きく影響するため、JC-1をロードした細胞を氷冷スタンディングバッファーで開始することを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、遺伝子操作などの他の方法を実行して、MMPの減少がMPTPの開始に起因するかどうかなどの追加の質問に答えることができます。