回転運動の定量化システム (リクエスト) を用いたキイロショウジョウバエの運動レベルの測定
2018年5月27日
回転運動の定量化システム (リクエスト) は、動物によって実行されるアクティビティの量を同時に測定しながら回転をショウジョウバエ運動を引き起こすことができます。今回、リクエストを使用して回転運動治療法を経験している動物の活動レベルを測定する方法を詳述したポイントによってプロトコル
この方法は、年齢によって運動反応がどのように異なるのか、運動反応を制御する遺伝的経路は何かなど、運動生物学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、研究者が初めて、回転運動を行うハエの活動をリアルタイムで測定できることです。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるLouis Patrick Watanabeです。
計画された実験の前に、オスとメスのハエの交配を設定して、実験のために制御された各子孫を収集できるようにします。まず、バイアルごとに8本のガラス製試験片チューブに10個の麻酔テストフライをロードします。標準的な実験グループは、各性別の10匹のハエの10バイアルで構成されています。
バイアルをREQSにロードするには、バイアルをアクティビティモニターのスロットに正面から挿入します。次に、バイアルに2番目のキャップを取り付け、バイアルの中央に置き、必要に応じてOリングを動かします。REQSをインキュベーターに収納し、制御された環境条件に対応します。
動物がこのインキュベーターで1時間麻酔から回復するのを待ってから、先に進みます。8時間を超えるアッセイでは、チューブの一端に非常にしっかりと取り付けられている食品を含むバイアルを使用することができます。順応期間が経過すると、デバイスの電源を入れて回転を開始します。
速度を4RPMなどの希望の速度に調整します。チューブが適切に配置されている場合、チューブが底面に接触しないようにしてください。一般的なアッセイでは、ソフトウェアを起動し、必要な時間(例えば、バイアルを食事なしで使用した場合の2時間など)の活性を記録するだけです。
開始すると、ソフトウェアは自動的にデータをテキストファイルに保存します。ソフトウェアでは、緑色の接続ライトは、ソフトウェアがデータを収集していることを示します。録音周波数は、[設定]タブで調整できます。
通常、5 分間隔が使用されます。アッセイ中は、動物があらゆる障害に非常に敏感であり、活動の増加とともに反応する可能性が高いため、インキュベーターを開かないでください。アッセイの最後に、ソフトウェアを閉じてデータ収集を終了し、REQSをオフにしてチューブを検査します。
運動期間中に発生した死亡者に注意してください。一般的に、2時間で4回転は健康な株にとって致命的ではありません。最後に、ハエに二酸化炭素を麻酔してバイアルを降ろします。
データファイルは、任意の統計パッケージで分析できます。すべてのポジションでアクティビティ スコアが 0 が記録される時点がある場合は、これらの時点で接続に切り欠きがありました。切り欠きが発生した場合は、回転するフォーンジャックにつながる接続をテープで安定させます。
遺伝的に異なる4つのショウジョウバエ系統を、記載されたプロトコルを用いてREQSでアッセイした。各グループは、100匹のハエを10本のバイアルに分割して構成した。平均活性は、4 RPM で実施された 2 時間のアッセイで 5 分間のビンで計算されました。
4つの遺伝子型すべての間の平均運動活動は有意に異なっていましたが、処女の雄と処女の雌のハエの間に有意差は見られなかったため、この分析ではそれらのデータを一緒に提示します。その開発後、この技術は、運動遺伝学の分野の研究者がショウジョウバエの様々な運動反応を探求し、動物の行動や生理学に対する運動の影響を研究する道を開きました。この手順に続いて、体組成分析、ストレステスト、フィットネステストなどの他の方法を使用して、動物に対する運動治療の影響に関する追加の質問に答えることができます。
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概要
回転運動定量システム（Rotating Exercise Quantification System: REQS）は、回転によってDrosophila melanogasterに運動を誘導し、同時にその活動レベルを測定することを可能にします。本プロトコルでは、回転運動処置を受けたハエの活動量を評価するための詳細な手法について解説します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 運動生物学
- 行動解析
- 遺伝的経路
背景
- 異なる年齢層における運動応答の理解。
- 運動応答に影響を与える遺伝的経路の調査。
- 運動中のショウジョウバエの活動量のリアルタイム測定。
- 実験セットアップにおけるREQSの活用。
研究目的
- 回転運動中のDrosophilaにおける活動レベルを測定すること。
- 運動に対する反応が年齢や遺伝的背景によってどのように異なるかを探求すること。
- 研究者が本研究を再現するためのプロトコルを提供すること。
使用した手法
- 雄および雌のDrosophilaの交配セットアップ。
- 麻酔をかけた試験個体フライのガラス標本管への導入。
- 複数のフライバイアルで構成される標準的な実験群。
- 回転運動中の活動のリアルタイムモニタリング。
主な結果
- REQSを用いたショウジョウバエへの運動誘発の成功。
- ハエの活動レベルに関するリアルタイムデータの収集。
- 運動応答における加齢に伴う差異についての知見。
- 運動行動に影響を与える遺伝的経路の特定。
結論
- REQSは、ショウジョウバエにおける運動生物学を研究するための有用なツールである。
- リアルタイム測定により、運動反応への理解が深まる。
- 今後の研究では、この手法を基盤として遺伝的影響を探索することが可能である。
よくある質問
業界における実用的重要性
回転運動定量システム（REQS）を用いてDrosophila melanogasterの運動誘発活性を定量化することで、遺伝学的および生理学的研究に関連する行動表現型の精密な測定が可能になります。この機能は、運動生物学、代謝調節、および行動遺伝学に焦点を当てた創薬パイプラインにおける初期段階のターゲットバリデーションやメカニズムのデリスキングを支援します。REQSによる標準化された定量的な出力は、系統間および条件間の比較を容易にし、トランスレーショナルリサーチにおける予測の信頼性を高めます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 扱いやすいモデルを用いて、運動応答の根底にある遺伝学的および生理学的経路の解析を可能にします。
- 遺伝子型、性別、および実験変数間での活動変化を定量化することにより、機能的なターゲットバリデーションをサポートします。
- リアルタイムで定量的な行動データを提供することで、メカニズム面でのリスク低減を促進します。
- グループ間での運動曝露を標準化することにより、後続研究における予測の信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- Drosophilaを用いた化合物または遺伝子スクリーニングのための、検証済みで再現性のある行動アッセイを構築します。
- ハイスループット解析に適した、定量的で時間分解能の高い活動データを提供します。
- 実験回数や研究チーム間でのアッセイの標準化と再現性を可能にします。
- 運動誘発性活動の修飾因子のスケーラブルなスクリーニングを支援します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 下流のアッセイによって裏付けられた場合、代謝調節やストレス応答などの疾患関連表現型と一致します。
- 遺伝学的発見からモデル生物を用いた前臨床検証までの連続性を提供します。
- 遺伝子型と表現型の関係を明確にすることで、リスクを調整した開発推進の意思決定を可能にします。
- 追加のエンドポイントと統合することで、トランスレーショナルなバイオマーカー開発における予測的なリスク低減をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
REQS法は、遺伝子操作、行動表現型解析、および運動生物学や関連分野における前臨床モデルの開発を橋渡しし、初期探索の連続的なプロセスへと統合されます。
- 探索生物学：遺伝的背景に応じた運動誘発活性を定量化することで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：化合物や遺伝的修飾因子の評価に適した、アッセイに使用可能な再現性の高い行動出力を提供します。
- 分析：実験群の堅牢な統計的比較を行うための、時間的にビン化された定量的な活性データを生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：生理学的アッセイやバイオマーカーアッセイと組み合わせることで、疾患に関連するエンドポイントとの整合を可能にします。
- エンタープライズ再利用：Drosophilaの研究ポートフォリオにおける行動表現型解析のための、標準化された再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 初期段階のターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム上の曖昧さを低減する。
- 運用的価値： チーム間で利用可能な、標準化され再現性のあるスケーラブルな行動アッセイを提供する。
- 戦略的価値： 遺伝子型と表現型の関係を明確にすることで、go/no-goの意思決定と資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響： 遺伝学的または薬理学的ターゲットのリスク調整済み優先順位付けと推進を可能にする。
実施上の留意点
- Drosophilaの取り扱い、行動アッセイの設計、および統計分析に関する専門知識が必要です。
- REQS装置、互換性のある活動量モニタリングソフトウェア、および制御された環境条件へのアクセスが必要です。
- アッセイパラメータおよびデータ分析ワークフローのチーム間での標準化が求められます。
- 異なるショウジョウバエの系統、齢、または実験変数に応じて調整が必要な場合があります。
- 潜在的な制限として、環境変動への感受性や、堅牢なデータ接続安定性の必要性が挙げられます。
