新鮮凍結ひと組織から腸管神経節の隔離のためのレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクションの最適化
2018年6月14日
このプロトコルの目標は、レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) を使用して固定されていない、新鮮な切除のひと腸管組織から分離した腸管神経節から整合性の高い RNA サンプルを取得することです。このプロトコルは、人間の腸組織、セクショニング、エタノール染色脱水、LCM、フラッシュ凍結サンプルの準備および RNA の抽出。
この方法は、成人の腸内神経節の発現プロファイルなど、腸神経系に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、RNAの品質を最大限に維持しながら、ヒト腸管から高収量のRNAを得るために使用できることです。腸組織を20センチメートルの長さにカットすることから始めます。
まず、脂肪組織と結合組織を切除します。筋神経叢の構造的損傷につながる可能性のある漿膜を傷つけないでください。次に、トリミングされたサンプルの全長に沿って、できれば腸間膜付着部位に縦方向に切開します。
次に、結腸から大腸菌を解剖して廃棄し、組織が平らになるようにします。次に、粘膜を下にして腸を冷やしたまな板に広げます。次に、組織の全長に沿って幅1.25センチメートルのストリップをカットします。
カットされたら、各ピースをチルドティッシュ保存液に移して一時的に保管します。次に、各ストリップを2〜1.5センチメートルの長さのセグメントにカットします。ストリップをセグメントにスライスした後、セグメントを拭き取って乾かします。
組織が凍結したときに組織に氷の結晶が形成されないように、組織が非常に乾燥していることが重要です。次に、乾燥したティッシュペーパーを粘膜側を上にして、冷たく使い捨てのプラスチック型に並べます。次に、湾曲した鉗子を使用して各ピースを平らにし、閉じ込められた気泡を取り除きます。
組織は平らになると膨張します。組織セグメントを平らにした後、凍結する前にそれらの厚さを評価します。必要に応じて、腸内サンプルが元の厚さに近づくまで、標本の端を内側に押し込みます。
次に、ロードしたベースモールドをドライアイスと2-メチルブタンのスラリーに移します。組織は30〜60秒以内に完全に凍結するはずです。その後、ドライアイスの上に置いておいたコールドワイプを使用して、型の底をすぐに乾かします。
では、サンプルを確認します。平らに見えないサンプルに注意してください。次に、事前にラベルを貼っておいたアルミホイルで型を包み、冷やしてから使用します。
次に、脱水症状を最小限に抑えるために、ホイルをラップの層で覆います。サンプルは、摂氏マイナス80度で保存できるようになるまで氷上に置いておきます。必要な材料を準備した後、3〜5mmのTFMのマウンドを大きなクライオスタット試料ホルダーに注ぎ、すぐに腸サンプルを漿膜側を上にしてTFMに移します。
室温で数秒後、試料ホルダーをドライアイスに移し、粉末ドライアイスで覆います。スライスする前に、TFMが筋腸神経叢の平面の下にあることを確認してください。次に、試料ホルダーをクライオスタット試料ヘッドに取り付け、試料をクライオスタットブレードに位置合わせします。
筋腸神経叢の平面をカッティングブレードと平行にします。次に、漿膜と縦筋を通って8ミクロンのセクションを作り、筋腸神経叢に到達します。腸神経叢の位置を特定するには、サンプルをマウントし、1%crystal violetなどの水性色素で染色します。
続行するには、縦方向の筋肉層と円形の筋肉層の間の接合部を特定します。切片化の開始時に、漿膜は結合組織の存在によって特徴付けられます。残っている腸間膜脂肪の一部も血清に沿って存在する可能性があります。
次に、外側の縦筋層のシートが見えるようになります縦筋層と円形筋層の境界に達すると、腸管神経節の一部が観察されます。次のいくつかのセクションでは、筋腸神経叢が非常に明白になり、1つのセクション内に神経節の大きな帯が存在します。次に、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション用のシリアルセクションを収集します。
PENをクライオスタットで5〜10秒間冷却し、それらを使用して切片を取り付けます。最高のセクションには、たくさんのニューロンとグリアがあります。次に、テキストプロトコルで説明されているように、切片を染色してから脱水します。
準備として、LCMキャップのカートリッジをLCM顕微鏡ステージに挿入します。次に、サンプルスライドをステージにロードし、スライドの概要画像を取得します。LCMの目的の場所を特定し、スライドにキャップをロードします。
次に、赤外線レーザーの位置を合わせ、レーザーの出力と持続時間を調整して、直径20〜30ミクロンのキャプチャスポットにします。次に、収集する目的の神経節の概要を説明します。キャップの収集エリア(緑色の円で表示されている)の境界内にとどまるようにしてください。
UVカッティングトレースで輪郭が描かれた神経節ごとに、100〜500ミクロンごとに少なくとも1つのIRスポットが存在するようにIRスポットを調整し、キャップがサンプルから持ち上げられたときに神経節がすべて収集されるようにします。次に、IR UVカットボタンを押して、マークされたすべての神経節の収集を続行します。収集が完了したら、キャップを新しい場所に移動し、収集プロセスを繰り返します。
これを60〜80分間繰り返すことができます。LCMキャップに十分な神経節が充填されたら、品質管理ステーションに移します。キャップに破片がある場合は、RNA用に調製した先端の細いペイントブラシを使用してキャップを拭き取ります。
破片を取り除くのが難しい場合は、ピペットチップを使用してください。次に、230マイクロリットルのRNA溶解バッファーを充填した0.5ミリリットルのマイクロフュージチューブにキャップを固定します。キャップを裏返し、短時間ボルテックスした後、サンプルを室温で30分間インキュベー
トします。その後、サンプルを5, 000 g以上で5分間遠心分離し、マイクロチューブをドライアイスに移します。これで、サンプルを RNA 抽出する準備が整いました。1サンプルにつき腸管神経節のキャップを2つ引っ張ると、RNA-Seqに十分な1ナノグラム以上のRNAが得られ、RNAの品質は優れていました。
示されているサンプルのRNA完全性は8.3です。完全性番号が7.5および6.9のサンプルも収集されました。合計すると、調製したサンプルの95%以上がRNA-Seqに十分なものでした。
RNA-Seqデータセットの品質は、バイオインフォマティクスパイプラインを使用して評価されました。エンドバイアスは、サンプルのシーケンシングが成功し、3つのプライムエンドバイアスがわずかであったことを示しています。遺伝子バイオタイププロットは、シーケンシング結果がほぼ一貫していたことを示しています。
この手法を習得すれば、RNA-Seqに十分な質と量のRNAの生物学的複製を腸管神経節からわずか8時間から12時間で収集することができます。この手順を試みるときは、人間の腸サンプルをできるだけ平らに凍結することが重要です。これにより、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションと迅速かつ容易に処理されるヒト腸神経節の非常に大きな断面を収集することができます。
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概要
本研究では、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）を用いて、摘出直後のヒト腸管組織から単離した腸管神経節から、高純度のRNAを抽出するためのプロトコルについて概説します。この手法は、ヒト腸管における腸管神経系の発現プロファイルを調査することを目的としており、胃腸管内における神経機能の理解を深めるものです。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 分子生物学
- 消化器病学
背景
- 腸神経系は、胃腸機能において極めて重要な役割を果たしています。
- 遺伝子発現プロファイルを研究するためには、高品質なRNAが不可欠です。
- レーザーキャプチャーマイクロダイセクションにより、細胞構造を精密に単離することが可能です。
- この技術により、完全な組織から詳細な分子解析を行うことができます。
研究目的
- ヒト腸管神経節から高収量でRNAを回収すること。
- 組織へのダメージを最小限に抑えつつ、RNAの品質を維持すること。
- ヒト腸管神経系の遺伝子発現プロファイルを評価すること。
使用した手法
- ヒト組織サンプルからの腸管神経節のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）。
- 摘出直後の腸組織を処理し、神経節を単離した。
- 重要な工程として、凍結切片作成、染色、および脱水が含まれる。
- 高いRNA完全性を確保するため、LCMの手法に続いてRNA抽出を行った。
主な結果
- 本プロトコルにより、シーケンシングに十分な高品質のRNAが1 nanogram以上得られた。
- RNA整合性（RIN）は、RNA-Seqに適した極めて良好なRNA品質であることを示した。
- サンプルの95%以上がシーケンシング解析に十分な量であった。
結論
- 本研究では、ヒト腸管神経節からRNAを単離するための効果的な方法を実証しています。
- 得られた結果により、腸管神経系の分子メカニズムについてより深い知見を得ることが可能になります。
- この手法は、胃腸疾患および神経機能に関する研究に寄与するものです。
よくある質問
産業界における重要性
レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）により、ヒト腸管組織から腸管神経節を精密に単離することが可能となり、トランスクリプトーム解析のための高純度なRNAを得ることができます。このアプローチは、一次ヒト組織から疾患に関連する分子データを提供することで、胃腸神経科学におけるターゲットバリデーションを支援します。本手法は、腸管神経系経路に焦点を当てた初期探索ワークフローにおいて、生物学的ノイズを低減し、予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 腸管神経節の純粋な集団を単離してRNA-seq解析を行うことで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値： 周囲の組織層からのコンタミネーションを最小限に抑えつつ、RNAの完全性を維持する。
- 科学的価値： 疾患に関連するヒト神経組織において遺伝子発現を直接測定することで、メカニズム面でのリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 再現性のあるトランスクリプトーム解析に適した、標準化された高品質なRNA入力サンプルを生成します。
- 運用的価値： PEN膜スライドとエタノール適合性染料を使用することで、捕捉効率とRNA収量を向上させます。
- 科学的価値： アッセイの適格性評価のために、定量的従属変数（例：RNA整合性数）の測定を可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： 創薬研究と前臨床検証を橋渡しする、疾患に関連したヒト組織データを提供します。
- 実用的価値： 下流のシーケンシングアプリケーションに十分な量（1サンプルあたり>1 ng）のRNAを回収できます。
- 科学的価値： ヒト組織における腸管神経系の標的プロファイリングを可能にすることで、トランスレーショナルなバイオマーカー探索を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
LCMのワークフローはディスカバリーバイオロジーの段階に適合し、リード化合物の同定に先立つ仮説検証およびパスウェイの解明を可能にします。これにより、標的選択におけるGO/NO-GO判定の根拠となる定量的な分子リードアウトを生成します。本手法では、企業規模のスクリーニングキャンペーンを支援する、再利用可能な標準化組織標本を作成できます。
- 探索生物学： 分子プロファイリングのために純粋なニューロン集団を単離し、仮説検証を容易にします。
- スクリーニング： 標準化された高完全性のRNAサンプルを提供し、化合物の効果を信頼性高く測定することを可能にします。
- 分析： RNA整合性番号（RIN）および収量メトリクスを提供し、シーケンシング前にサンプルの品質を評価します。
- トランスレーショナルリサーチ： 保存された遺伝子発現パターンを通じて、ヒト組織のデータと前臨床モデルを関連付けます。
- エンタープライズでの再利用： 複数の組織ブロックおよび実験条件下で神経組織を単離するための、スケール可能なプロトコルを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：神経標的バリデーションにおけるメカニズムの曖昧さを低減し、予測の信頼性を向上させる。
- 運用の価値：組織調製、染色、およびLCMパラメータの標準化により、再現性を高める。
- 戦略的価値：ヒトで検証された分子データの迅速な取得を可能にし、資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響：ヒト腸管神経系の発現プロファイルに基づいた、リスク調整後の標的優先順位付けを支援する。
実施上の検討事項
- 組織の取り扱い、凍結切片作成、およびレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）の専門知識が必要です。
- クリオスタット、LCMシステム、およびRNA適合性のある染色試薬（例：Cresyl Violet）に依存します。
- 組織の展平、凍結、および切片の方向設定に関する標準化されたプロトコルが必要です。
- スケールアップの際は、ドナー間や腸管の領域間における組織の変動を考慮しなければなりません。
- サンプルを迅速に処理するか、十分に乾燥した状態に保たない場合、RNA分解のリスクによる制限があります。
