ネクロトーシス MLKL を介した細胞膜破壊の解析

これらの方法は、膜転座や脂質結合の透過化などのネクロプトーシスにおける偽キナーゼ混合系統キナーゼドメイン様またはMLKLの役割に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、ネクロプトーシスにおける原形質膜破裂の執行者としてMLKLを直接関与させることです。生細胞イメージングは、特にMLKLを介したネクロプトーシスにおいて、細胞死研究の分野に革命をもたらしました。

核磁気共鳴は、MLKLで実証されているように、タンパク質への脂質結合をモニタリングするための強力な技術です。まず、オリゴマー化カセットとVenusに融合したMLKLの死刑執行ドメインを発現するMLKLノックアウトマウス胚性線維芽細胞またはMEFを、1ミリリットルの補充DMEMに24ウェルプレートで5回10回10回プレーティングし、細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートします。翌朝、ドキシサイクリンで細胞を12時間処理して導入遺伝子の発現を誘導し、続いてFK506結合タンパク質二量体化剤と膜不透過性緑色蛍光色素を添加した標準DMEMを添加してネクロプトーシスを誘導します。

細胞死をモニターするには、プレートを哺乳類組織培養インキュベーターに収容された適切なイメージングユニットに置き、イメージングシステムソフトウェアを開きます。「スケジュール・カミング・カッシング・スキャン」タブを選択し、「物理レイアウト」タブでトレイ、容器、スキャン・タイプ、スキャン・パターンを選択します。「Properties」タブで「fast fluorescence」を選択し、「Timeline」ウィンドウをクリックし、取得の時点と頻度の合計数をクリックして、スキャン時間を追加します。

次に、[適用]をクリックして画像取得を開始します。ネクロプトーシスを定量化するには、タスクペインを選択し、マウスカーソルを複数の画像の背景上に置いて、背景レベルより上の固定セグメンテーションしきい値で新しい分析をカウントするオブジェクトを設定します。次に、[プレビュー] を選択して現在の画像内の蛍光オブジェクトを調べ、必要に応じてしきい値レベルを調整します。

閾値の慎重な選択は、プレート上のマルチウェルを観察し、ソフトウェアのプレビュー機能を使用して実行できます。プレート内のすべてのウェルに同じしきい値設定を使用することに注意してください。緑色の蛍光カウントを統合するには、[Launch New Analysis]タブで、分析する時間範囲とウェルを選択し、分析ジョブ名を入力します。

次に、[OK]をクリックし、ジョブ名をダブルクリックして、適切なグラフ作成ソフトウェアプログラムでの追加分析のためにデータをエクスポートします。核磁気共鳴分光法またはNMRによるMLKLの脂質結合には、気密シリンジを使用して、目的のリン脂質1ミリリットルあたり1ミリグラムを個々のNMR滴定シリーズ用のクリーンなガラスバイアルに分注し、バイアルをアルゴンまたは窒素のガス流下に5〜30分間置きます。クロロホルムやメタノールなどの揮発性溶媒からの脂質分注は、溶媒の蒸発によるサンプル間の脂質濃度の不整合を最小限に抑えるために、ドライアイス上に保管された備蓄から迅速に行う必要があります。

蒸発期間の終わりに、大きなピンセットを使用して、バイアルをブフナーフラスコの底に配置します。フラスコをゴム栓で密封し、真空ラインに接続されたプラスチックチューブを取り付けて、バイアルの内容物を穏やかな真空下で一晩排気し、残留有機物を取り除きます。翌朝、脂質膜を有する各ガラスバイアルに適切な実験濃度の界面活性剤を添加したNMR緩衝液を添加し、バイアルを最大30分間水浴中で超音波処理し、10分ごとに超音波処理を停止して脂質膜の可溶化を確認する。

超音波処理の終わりに、バイアルを15分間冷却し、界面活性剤陽性NMR緩衝液中で脂質界面活性剤ミセルの段階希釈を行い、所望の濃度シリーズについて1:1混合物を超音波処理する。界面活性剤陰性NMRバッファーおよび界面活性剤陽性NMRバッファー中のタンパク質および添加剤のNMRサンプルをそれぞれ調製し、界面活性剤陽性バッファー中の各脂質希釈液にタンパク質および添加剤を添加します。次に、適切な量のサンプルを適切なサイズのNMRチューブに移し、サンプルをNMR装置にロードします。

MLKLノックアウトMEFの完全なネクロプトーシスは、融合した導入遺伝子を発現するドキシサイクリンプレインキュベート細胞の二量体媒介オリゴマー化から1時間以内に観察できます。この高速動態ネクロプトーシスは、原形質膜破裂の推定執行人としてのMLKLの役割を支持し、その結果、細胞末梢の二量体と金星コードによる治療から1〜2分以内に血漿膜関連金星点が産生され、2〜3分以内に細胞が徐々に丸められます。高速ネクロプトーシス下では、細胞はオリゴマー化から5分以内に通常の細長い形状から丸みを帯びて膨潤し、10分で部分的に破裂し、20分で消失したサイトゾルで広範囲に解体されます。

NMR分光法でモニターされたin vitro脂質結合実験では、脂質結合によるMLKL実行ドメインタンパク質の主要な構造変化が明らかになり、阻害ブレース領域が閉じたN-ヘリカルから開放型で天然変性のコンフォメーションに置換され、両方のコンフォーマーの混合物に関する残基ごとの情報が得られます。また、特定のサンプル中の閉配座異性体と開放配座異性体の割合をモニターすることもでき、MLKL実行ドメインとリン脂質との相互作用を裏付ける証拠を提供し、MLKLと原形質膜との直接的な関連性を示唆しています。したがって、この手順を使用して細胞死を定量しようとする際には、DNA結合色素が通常の遺伝的にコードする蛍光タンパク質よりも高い閾値蛍光を持っていることを知り、覚えておくことが重要です。

このため、これらは並行して使用できます。また、ミセル脂質は温度に敏感であるため、NMRサンプルの温度を最適化する必要がある場合があることにも注意してください。したがって、この手順に続いて、全反射顕微鏡法や電気顕微鏡法などの他の手法を使用して、ネクロプトーシスを受けている細胞で細胞破裂がどのくらいの速さで起こるか、そして破裂が原形質膜のどこに局在しているかに対処することができます。

さらに、マイクロスケールの熱泳動を実施して、ミセル脂質へのMLKL結合を直交的に検証できます。このビデオで説明されている技術は、ネクロプトーシスの分野の研究者が、原形質膜破裂の執行人としてのMLKLの役割を探求する道を開きました。クロロホルムでの作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、手袋を着用したり、換気の良い場所で作業したりするなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。