心の血管外免疫細胞の分離と同定

この方法は、定常状態と疾患状態の両方で、心臓内の免疫細胞サブセットの組成に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、非常にまれなサブセットを含む心免疫細胞集団の正確な免疫表現型解析に使用できることです。このプロトコルは比較的単純です。

しかし、尾静脈注射は難しい場合があるため、実験動物を使用する前に、慣れるまでこのテクニックを練習することが重要です。循環白血球を標識するには、新たに調製したマウス蛍光色素標識抗CD45抗体200マイクロリットルをPBSに28.5ゲージのインスリン注射器にロードし、摂氏35〜41度に設定された循環水ブランケットで12週齢のマウス8匹を5〜10分間予温します。尾静脈が拡張したら、適切な拘束装置で最初の動物を胸骨位置に拘束します。

尾静脈が十分に拡張していない場合は、尾を摂氏36〜40度の水に1〜2分間浸します。尾静脈の準備ができたら、70%エタノールに浸したガーゼで注入領域を綿棒で拭き取り、人差し指と中指で尾の付け根を固定し、親指と薬指で尾の中央遠位領域を固定します。針の斜角側を上にして静脈と平行に保持し、拡張した尾静脈に針を挿入し、抗体の全量を静脈内注射します。

その後、人道的な安楽死の前に抗体を5分間循環させます。心臓を採取するには、マウスに70%エタノールをスプレーし、腹部の皮膚を持ち上げて、腰から胸骨までの腹側正中線に沿って腹部を開きます。腹膜を開き、肝臓を動かして横隔膜を露出させます。

横隔膜と正中線の両側の肋骨を切断し、肺と心臓に穴を開けないように注意します。肋骨を剥がして心臓を露出させてから、左右の心房を切開します。鉗子で心臓の基部を優しくつかみ、60ミリリットルの注射器に取り付けた21ゲージの針を頂点近くの左心室に挿入し、15〜20ミリリットルの冷たいPBSで心臓を灌流します。

血管内汚染物質を避けるためには、心臓の適切な灌流が不可欠です。したがって、凝固した血液による汚染を避けるために、安楽死後すぐに心臓を解剖して灌流するように注意してください。先ほど示したように右心室を灌流した後、白い肺と青白い肝臓が観察されるはずです。

鉗子で心臓の基部を押さえると、心臓が優しく引き上げられ、主要な肺動脈と静脈、大動脈、心嚢が切断され、心臓組織を剥離します。親指と人差し指で心臓を優しく保持し、清潔な糸くずの出ないペーパータオルで心臓を丁寧に洗浄し、鉗子を使用して心房と主要な動脈や静脈の残り、またはその他の汚染物質を取り除きます。きれいにした心臓を5センチのプラスチック皿に入れ、50マイクロリットルの冷たいPBSを追加します。

湾曲した解剖はさみを使用して、目に見える部分がなくなり、組織が滑らかで厚い粘稠度を持つまで心臓をミンチにします。湾曲した鉗子を使用して、組織を800マイクロリットルの冷たいDMEMを含む2ミリリットルの微量遠心チューブに移します。コラゲナーゼ、DNase、およびヒアルロニダーゼを添加し、摂氏37度、50rpmで45〜60分間インキュベートします。

分解の最後に、ボルテックスサンプルを20秒間採取し、すぐに氷の上に置きます。特に指定がない限り、サンプルは常に摂氏4度に保つ必要があります。これは、室温で放置すると一部の表面抗原が内在化する可能性があります。次に、140マイクロリットルのセルストレーナーを、1ミリリットルの冷たいHBBを含むサンプルあたり50ミリリットルの円錐管に予め濡らします。

1ミリリットルのピペットを使用して、組織懸濁液が均一になるまでサンプルをピペットで固定し、ピペットチップを詰まらせないようにして、均質化されたサンプルをフィルターに加えます。サンプルごとに12〜14ミリリットルの冷たいHBBでフィルターを通してサンプルをゆっくりと洗浄し、ろ過したサンプルを氷上の標識された15ミリリットルの円錐管に移します。良好な消化は、フィルター内に心臓が残っていないことによって実証されます。

遠心分離によりサンプルを採取し、上清を除去します。各サンプルに1ミリリットルの塩化アンモニウムカリウム溶解バッファーを加えます。サンプルを短時間のボルテックスで再懸濁した後、室温で5分間インキュベートします。

その後、5〜8ミリリットルの冷たいHBSSで溶血を止めます。遠心分離によりサンプルを採取し、ペレットを1ミリリットルの蛍光活性化細胞ソーティングまたはFACSバッファーに再懸濁し、個々の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移して別の遠心分離を行います。フローサイトメトリーでサンプルを解析するには、ペレットを50マイクロリットルの抗CD16/CD32抗体と単球ブロッカーに再懸濁して、室温で15分間インキュベートして非特異的抗体の結合を減らします。

洗浄せずに、50 μリットルの抗体マスターミックスを各サンプルに加え、4°Cで30分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、チューブあたり600マイクロリットルのFACSバッファーでサンプルを洗浄し、ペレットを300マイクロリットルの新鮮なFACSバッファーまたは1%パラホルムアルデヒドに再懸濁します。次に、標準的なフロー解析プロトコルに従って、フローサイトメトリーにより心臓白血球を分析します。

フローサイトメトリーによる心臓のシングルセル懸濁液の解析には、心臓の非免疫細胞と免疫細胞を区別するためにCD45によるプレゲーティングが必要であり、その後、シングルセルおよびスモールサイズ排除ゲーティングが必要です。CD64の発現によって同定されるマクロファージは、心臓の主要な免疫細胞集団であり、全免疫細胞の60〜70%を占めています。従来の心臓樹状細胞は、MHCクラスIIおよびCD11cを高レベルで発現するCD64陰性細胞です。

これらの細胞は、CD103またはCD11bのいずれかの発現に基づいてさらに分割することができ、マクロファージと比較してはるかに小さな心臓亜集団を表します。心筋の単一細胞懸濁液のフローサイトメトリーを使用すると、心臓内の小さな白血球亜集団の研究が可能になります。例えば、フローサイトメトリー解析を用いて野生型マウスの心筋の免疫細胞をBatf3欠損マウスと比較すると、ノックアウト動物内でCD103陽性樹状細胞が存在しないことを確認できます。

さらに、この分析では、Batf3欠損動物における他の心集団の組成に有意な変化がないことが示され、この酵素消化と機械的消化の組み合わせ方法を使用して単一細胞懸濁液を達成できる感度の程度が示されました。この手順を試みる際には、細胞分離株の生存率を常に考慮することが重要です。したがって、実験条件に応じて消化の時間と酵素濃度を最適化することをお勧めします。

この手順に続いて、シングルセルRNAシーケンシング、機能アッセイ、磁気ビーズ単離などの他の方法を実行して、単離された細胞の機能に関する追加の質問に答えることができます。