切削とフローティング区分のための組織のパラフィン包埋法
2018年9月5日
ここでは、パラフィン切片を改善するためのプロトコルを提案する.このメソッドは、切断と従来の方法に必要な転送処理を避けるために簡単な恒温室を使用して浮動小数点を兼ね備えています。その結果、そのままパラフィン切片数と効率が大幅に向上。
この方法は、パラフィン切片などの形態学的分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、切断と折り畳み手順を最高潮にし、従来の方法で必要とされる転写プロセスを回避することです。まず、事前に製造されたすべての部品をドラフトに集めます。
ここに示すように、クロロホルムを使用して7枚のアクリル板を組み合わせます。最終製品は、セクションチャネルとウォーターバスを備えたタンクになります。アクリル板番号2の穴を通して管状電気発熱体を取り付けます。
電気ドリルを使用して、アクリル板の7番に小さな穴を開け、デジタルサーモスタットをタンクに取り付けて、タンクの黒い点で示されている目的の水面のレベルから少なくとも1センチメートル下にあることを確認します。巻を調整するtag機器の電源を入れる前に、24ボルト未満になるようにします。切片廃棄物トレイをミクロトームから取り外します。
次に、中性シリコーンシーラントを使用して、セクションチャネルをミクロトームブレードホルダーにリンクし、ブレードの上部にシーラントが入らないようにします。セットアップを一晩乾燥させて、クロロホルムと中性シリコーンシーラントが固まる時間を与えます。翌日、ブレードをブレードホルダーに取り付けます。
ウォーターバスに水を加え、水面がブレードの上部にちょうど触れていることを確認します。従来のパラフィン切片化を行った後、装置の電源を入れると、改善されたパラフィン切片化が開始されます。温度検出スイッチを使用してヒーターを開きます。
目標温度を38°Cから40°Cの間で1時間設定し、お湯を温めます。パラフィン包埋によって取得されたパラフィンブロックをナイフで改変します。次に、ブロックをミクロトームのカセットクランプに置き、ロックします。
厚い部分をカットして、サンプルにすばやく近づきます。サンプルに適したセクションの厚さに調整します。ハンドホイールを回すと、セクションが自動的にセクションチャネルとバスにロードされます。
次に、ゆっくりと均一な切断ストロークで試験片を切片にします。セクションを浴槽に導き、一列に浮かぶようにします。ヘッド部がチャンバー壁に密着している場合は、ブラシガイドを使用して浮かせてください。
切片がウォーターバスで完全に展開されたら、ピンセットを使用していくつかを分離し、顕微鏡スライドでそれらを拾います。スライドを摂氏42度に設定されたオーブンに移し、一晩乾かします。その後、スライドは分析の準備が整うまで無期限に室温で保存できます。
分析の準備ができたら、ヘマトキシリン-エオシン染色を使用して、改良された方法を使用して切片を評価します。この研究では、改良された方法を使用して、成体マウス海馬組織、成体マウス腎臓、胚性マウス脳、およびゼブラフィッシュの眼のパラフィン切片を調製します。ここに示すように、新しい方法は切片の損失を回避し、検査された組織の各タイプにおける無傷の切片の割合を増加させます。
全シリーズ切片化を行う場合、この方法により、試験したすべてのサンプルでパラフィン切片化の速度が加速することが確認されています。つまり、従来の方法よりも短時間で高品質なパラフィン切片化が可能となります。次に、ゼブラフィッシュの視神経網膜のシリーズ切片をヘマトキシリン-エオシン染色によって観察します。
改良された方法から収穫された切片は、従来のパラフィン切片法から収穫されたものよりも優れた完全性を持っていることが分かります。これら2つの方法を比較すると、ほとんどの採取された切片の品質に大きな違いはありませんが、従来の方法で採取された一部の切片は比較的低い品質であることがわかります。クロロホルムでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常にヒュームフードなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。
この手順を試すときは、注意深く水を追加し、過剰に充填しないように注意することが重要です。
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概要
本記事では、切片作成と浮遊を恒温槽内で行うことで、従来の転送工程を不要にし、パラフィン切片作成を効率化するプロトコルを紹介します。この改良により、パラフィン切片の作成効率と切片の完全性の双方が大幅に向上します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 組織学
- 神経科学
- パラフィン切片作製技術
背景
- 従来のパラフィン切片作成には複数の転送ステップが含まれており、しばしば切片の消失を招きます。
- 新しい手法ではプロセスが合理化され、完全な切片の回収率が向上します。
- 切片作成の精度向上は、さまざまな生物学的組織における正確な形態学的解析に不可欠です。
研究目的
- 破損のないパラフィン切片の数を増やすためのプロトコルを提示すること。
- 生物学的研究におけるパラフィン切片作成に要する時間を短縮すること。
- マウスおよびゼブラフィッシュ組織のより優れた解析を促進すること。
使用した方法
- 本記事では、恒温チャンバーを用いた切片作成法について詳述します。
- 成マウスの海馬組織、腎臓、マウス胚の脳、およびゼブラフィッシュの眼のパラフィン埋没および切片作成を実施しました。
- 装置の温度設定および具体的な設置手順について概説します。
- 重要な工程として、加熱エレメントの慎重なセットアップおよび切片作成手順が含まれます。
- その後、切片をヘマトキシリン・エオジンで染色し、評価を行います。
主な結果
- このプロトコルは、従来の手法と比較して、損失を抑えつつより高品質な切片を得られることが示されています。
- ゼブラフィッシュの視覚網膜やマウス組織など、さまざまな組織型において、切片の完全性が向上していることが観察されました。
- この手法により、品質を維持しながらパラフィン切片作成プロセスを加速させることができます。
結論
- 本研究では、組織サンプルの完全性を維持しつつ、より効率的にパラフィン切片を作成するためのプロトコルを提示します。
- 短時間でより高品質な結果を得ることで、形態学的研究を促進します。
- 組織学的解析において正確な切片作成を必要とする研究者にとって、本手法は極めて有用です。
よくある質問
産業における重要性
パラフィン切片作成は、組織学のワークフロー、特に創薬生物学におけるハイスループットなターゲットバリデーションや表現型スクリーニングにおいて、依然としてボトルネックとなっています。本手法は、切片の完全性とスループットを向上させ、ダウンストリームのアッセイ結果やメカニズムのリスク低減に向けた取り組みを妨げる技術的変動を減少させます。信頼性と再現性の高い組織調製を可能にすることで、神経科学および腫瘍学モデルにおけるターゲットエンゲージメント研究の予測信頼性をサポートします。
バイオ医薬品の研究開発における戦略的応用
早期発見およびターゲット検証
- 科学的価値：標的の局在化およびパスウェイ解析のため、完全性の高い組織形態を通じて治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値：切片の喪失と手動での転送ステップを減らし、実験あたりの有効な組織回収率を向上させる。
- 予測的価値：標的への結合（ターゲット・エンゲージメント）および作用機序研究に不可欠な、一貫性のある組織学的読み取りをサポートする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：免疫組織化学およびin situハイブリダイゼーションアッセイに適した、標準化された無傷の切片を作成します。
- 運用の価値：切片作成のワークフローを効率化し、習熟度の低いオペレーターでも品質と一貫性を維持できるようにします。
- アッセイへの適合性：シグナル検出を妨げる組織アーティファクトを最小限に抑えることで、信頼性の高い化合物の評価を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： マウスやゼブラフィッシュの組織を含む、疾患に関連する系において形態学的忠実性を維持します。
- 運用の価値： 技術的失敗を低減し、創薬から前臨床検証までの継続性を促進します。
- リスク軽減： 縦断的研究における生物学的ノイズを低減し、リスク調整後の進展判断をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期のターゲットバリデーションからリード最適化に至る創薬の連続的なプロセスに適合し、信頼性の高い組織学的評価がGo/No-go判断の根拠となります。
- 探索生物学： 標的バリデーションおよびバイオマーカーの共局在化に向けた、完全な組織切片による仮説検証をサポートします。
- スクリーニング： 定量的なイメージングおよび染色に適した均一な切片を提供することで、アッセイの再現性を向上させます。
- 分析： 実験条件間での正確な比較を可能にする、高品質な形態学的データを生成します。
- トランスレーショナルリサーチ： 種や発生段階を問わず一貫した組織調製を行うことで、前臨床段階における連続性を促進します。
- 企業内での再利用： 複数のプロジェクトや治療領域に適用可能な、拡張性のある低コストな機能を提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 切片の欠損を減らし、形態学的完全性を向上させることで、予測の信頼性を高めます。
- 運用的価値： 装置の簡素化と操作者の習熟度への依存を低減し、切片作成を標準化します。
- 戦略的価値： 組織学的ワークフローを加速させ、切片の作成失敗による試薬の浪費を削減することで、資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： 標的バリデーションおよび安全性薬理学のための信頼性の高い組織学的データを提供し、リスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 基本的な組織学的専門知識に加え、ミクロトームの操作およびパラフィン包埋への習熟が必要です。
- ミクロトーム、オーブン、染色試薬を含む標準的な実験器具と、カスタムアクリルチャンバーアセンブリが必要です。
- 再現性を確保するため、切片の厚さ、温度管理、およびウォーターバスの準備について、チーム間での標準化が求められます。
- 適応上の検討事項として、サンプルの密度に応じて、切断速度および切片の厚さを組織特異的に最適化する必要があります。
- 実用上の制限として、アセンブリ中のクロロフォームの安全な取り扱いが必要であり、ドラフトチャンバーの使用と適切な換気が不可欠です。
