高分解能X線吸収分光法を用いた極低温でのスペシエーションのための生体試料調製

このプロトコルは細胞標本用に標準化されており、異なるシンクロトロン位置で実行されている実験の比較を可能にします。この技術の主な利点は、サンプルの化学的統合の迅速かつ信頼性の高い保存を可能にするシンプルで簡単なワークフローです。この技術に慣れていない人は、凍結反復された細胞のペレット化と、クライオサンプルオーダーへの細胞ペレットの高速ロードに苦労するかもしれません。

極低温でのサンプルの正確かつ迅速なリンク解除は非常に重要です。そのため、視覚的なデモンストレーションは、テクニックの実行方法を理解するために不可欠です。セレン種分化のためのヒト前立腺および卵巣癌細胞株細胞ペレットを調製するために、各細胞株からの適切な数の細胞を層流フード内の適切な細胞培養培地中の条件ごとに3つのT−75フラスコに播種し、細胞が80%コンフルエントになるまでフラスコを摂氏37度および5%二酸化炭素細胞培養器に入れる。

癌細胞をセレン処理に曝露するために、最初に超音波ウォーターバス中で新たに調製したナノ粒子ストック溶液を室温で30分間超音波処理してから、セレンナノ粒子溶液を完全な細胞培養培地中で適切な作業濃度に連続的に希釈する。層流フード内で、洗浄ごとに5ミリリットルの37°CPBSで細胞を2回穏やかに洗浄し、滅菌25ミリリットルのピペットを使用して、フラスコの底に目的のセレン処理の15ミリリットルを慎重に加えます。フラスコを完全に密閉せずに蓋を閉め、フラスコを細胞培養インキュベーター内に水平に24時間置く。

培養液を洗浄して補充した後の細胞ペレットを調製するには、フラスコごとに1つのセルスクレーパーを使用して細胞を穏やかに剥離する。培地を使用して、フラスコに付着した細胞を上清にフラッシュし、解離した細胞を遠心分離によって収集する。ペレットを1回の洗浄につきチューブあたり5ミリリットルのPBSで2回洗浄して、処理の残りの痕跡をすべて除去し、細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁する。

細胞を1.5ミリリットルのポリプロピレンチューブに移し、別の遠心分離で細胞を回収する。次に、200マイクロリットルのピペットを使用してすべての上清を静かに除去し、各1.5ミリリットルチューブの底部を細胞ペレットのレベルまで液体窒素に突っ込んだ。凍結直後に、チューブを液体窒素デュワーに移して長期保存する。

高分解能X線吸収分光法では、目的の蛍光線エネルギーに対してブラッグ条件で結晶分析計分光計からのすべての結晶を最適化し、吸収端のエネルギー位置が既知である基準を使用して、入射単色ビームエネルギーを較正します。試料ホルダーを生体試料用液体ヘリウムクライオスタットに移し、クライオスタットを10ケルビンに設定し、シンクロトロン安全規則に従って実験ハッチを閉じ、分析を開始する。ここで、初期状態および栄養培地にインキュベートされた細胞におけるセレンの代表的な高分解能X線吸収分光スペクトルは、初期セレンナノ粒子中のセレンがセレンゼロおよびセルライト様形態の両方として存在していたことを実証する。

しかし、PC3細胞との相互作用の後、セレンは主にセレンゼロとして細胞内に存在し、細胞内のセレン種の変化を実証した。鉄の場合、高分解能X線吸収分光法参照スペクトルは、鉄の酸化状態に応じて明確なエッジ位置を示し、鉄の還元種は低いエネルギー値にシフトする。珪藻ペレットの同じ位置で収集された2つの連続したスペクトルは類似しており、10ケルビンでヘリウムクライオスタットを使用した場合、ビーム損傷が2回の取得間で制限されたことを示している。

さらに、珪藻ペレットの異なる位置からのスペクトルは同一であり、サンプルペレットが均質であり、スペクトルを平均化してより良い信号対雑音比スペクトルを得ることができることを実証した。最も重要なステップは、ナノ粒子ディルチュイオンの調製、極低温でのペレット化、および標準参照サンプルの調製である。この手順は、ICP−MSもしくはHPLC−ICP−MSまたは他の非シンクロトロン分光技術などの他のバルク分析技術に適用することができ、極低温で形態を行うことができる。

この手順を使用して、特に生物地質学、生化学、環境科学または毒物学研究の分野で、他の科学的疑問を探求することができます。セレン化合物とセレンナノ粒子は、あなたの健康に困難な場合があり、手袋、眼鏡、フェイスマスクを使用して専用の化学フードで操作する必要があります。