ナノ流体技術を用いた単一およびバルク C.エレガンス サンプルにおける高スループット定量RT-PCR

当社のプロトコルは、RNA単離を必要とせずに、単一の1または小さなバルクサンプルから直接RT-qPCRデータを取得するためのスループットと時間効率の両方を改善しました。このプロトコルを使用すると、標準的な96ウェルqPCRを使用すると通常約5週間かかるこのプロセスを、わずか2日間のベンチワークで9,000を超えるRT-qPCR結果を得ることができます。このプロトコルは、C.elegansにおけるより迅速で堅牢かつ高感度のRT-qPCRアッセイを提供し、同質遺伝子線虫間の遺伝子発現の個体間変動のモニタリングに最適です。

まず、バクテリアの芝生から新鮮な種をまいていない線虫の成長培地プレートにワームを選び、ワームがプレートの周りを5分間移動するのを待ちます。線虫が順応している間に、RNaseフリーフードで、10マイクロリットルの溶解バッファーをサンプルあたり1〜100個のDnase Iと混合し、PCRストリップの蓋を逆さまにして解剖スコープのプラットフォームに置きます。次に、10マイクロリットルの溶解混合物をドーム型PCRチューブキャップに加え、プレートから線虫をすくい取り、蓋の各スロットに細菌が移らないようにします。

すべてのワームが移されたら、キャップを閉じてチューブを5秒間回転させてから、チューブを液体窒素のデュワーフラスコに入れます。最後の5秒後、チューブを摂氏40度の水浴で解凍してから、凍結/解凍手順をさらに9回繰り返します。最後の凍結融解サイクルの後、溶解したサンプルをサーマルミキサーで4°C、毎分約1800回転で20〜30分間混合します。

ミキシングインキュベーションの終了時に、示されているようにサンプルをスピンダウンし、解凍したばかりのストップ溶液を1マイクロリットル各チューブに加えます。バルク温サンプルの逆転写には、RNaseフリーフードで酵素バッファーマスターミックスを調製し、各サンプルの11マイクロリットルに14マイクロリットルのマスターミックスを加えます。示された逆転写プログラムを使用してサンプルをサーモサイクラーに通し、得られたcDNA産物をヌクレアーゼフリー水で1〜4の比率で希釈します。

ターゲット特異的なプレアンプでは、96ウェルプレートのサンプルあたり1ウェルに3.75マイクロリットルのプレアンプマスターミックスを添加し、マスターミックスの各ウェルに各cDNA溶液1.25マイクロリットルを添加します。すべてのサンプルがロードされたら、プレートをシーリングテープで覆い、サンプルを短時間ボルテックスしてから遠心分離でスピンダウンしてから、プレートをサーモサイクラーにロードし、指示どおりにプログラムを実行します。プレアンプから未取り込まれたプライマーを除去するには、サーモサイクルの最後にサンプルプレートを遠心分離し、シールを慎重に剥がします。

I Master Mixを各プレアンプ反応に2マイクロリットルのエキソヌクレアーゼを加え、再シール、遠心分離、プレートをサーモサイクラーに戻します。サイクルの最後に、サンプルを18マイクロリットルのTris-EDTAバッファーで希釈します。マルチアレイチップをセットアップするには、3.6マイクロリットルのアッセイローディングマスターミックスと0.4マイクロリットルの50マイクロモルフォワードリバースプライマーを384ウェルプレートのサンプルごとに1ウェルに加えます。

次に、2.2マイクロリットルのサンプルマスターミックスと、サンプルを処理した各プレアンプ化エキソヌクレアーゼ1.8マイクロリットルをプレートの適切なウェルに加えます。シングルアレイチップをセットアップするには、第2の384ウェルプレートの1サンプルにつき1ウェルに5.4マイクロリットルのアッセイローディングマスターミックスと0.6マイクロリットルのフォワードリバースプライマーを添加し、次いで3.3マイクロリットルのサンプルマスターミックスと2.7マイクロリットルの各予増幅エキソヌクレアーゼを調製したシングルアレイプレートの適切なウェルにサンプルを添加する。ナノ流体チップを最初のランでプライミングするには、チップを45度の角度でゆっくりと保持し、150マイクロリットルの制御ライン流体をチップのアキュムレータに慎重に注入します。

すべての液体がロードされたら、チップの底から青い保護フィルムをはがし、バーコードを外側に向けてチップをナノ流体PCRプライミングマシンに入れます。次に、Prime(153x) スクリプトを実行します。プライミング後、チップを暗い表面に置き、各アッセイまたはサンプルミックスをロードするときに、必要に応じて対応するバリアプラグを取り外し、実験計画に従ってナノ流体チップの対応するインレットに適切な量のアッセイまたはサンプルミックスを追加します。

ロード後、チップをナノ流体サーモサイクラーに入れ、データ収集ソフトウェアで適切なプロトコルを実行します。マルチアレイチップ全体を使用しない場合は、ポストスクリプト実行を実行して、残りのチップアレイをダウンストリームで使用できるようにします。worm-to-Ctプロトコルが有効なcDNA抽出法であるかどうかを検証するために、この方法を標準的なチオシアン酸グアニジウム-フェノール-クロロホルム抽出法と比較しました。

世界的に、全RNA100ナノグラムあたりのhsp-70 mRNA発現レベルは、フェノール-クロロホルム法とワーム-to-Ct法の両方を使用して同等でした。しかし、hsp-70の発現が最も高い場合、Worm-to-Ct法の方が発現が高く、感度が向上したことが示されました。バルクサンプルのグアニジウムチオシアン酸-フェノール-クロロホルム抽出では、hsp-70は対照と比較してhsf-1変異体で82.7減少し、ウォーム-Ctで92.3%減少し、2つの方法間で減少が同等であったことを示しています。

25匹の線虫のバルクサンプルまたは平均36匹の線虫サンプルから得られたcDNAを使用して、試験したすべてのシャペロンについて同等の発現レベルを検出し、1匹の線虫から得られたパラメーターが信頼できることを示しました。ここでは、短時間のヒートショック後の単一の線虫からの複数のhsp転写産物の平均発現を示しています。観察されたように、転写産物の発現の変動性は、遺伝子によって大きく異なります。

単一の線虫サンプルを使用して試験したすべての転写産物について、技術的な変動係数は生物学的な変動係数よりも低く、単一の線虫でqPCRを実行した場合、パラメーター推定に技術的なトリプリケートは必要なかったことを示しています。このプロトコルを実行する際には、少量を正確にピペットでピペットし、ナノ流体チップに逆ピペットで入れないことが不可欠です。このプロトコルは、大量のRT-qPCRデータを取得するために使用でき、ExcelまたはRスクリプトを使用して必要に応じてエクスポートおよび処理できます。