異種細胞系におけるタンパク質凝集による細胞間相互作用の測定
2020年5月22日
ここでは、蛍光顕微鏡を用いた異種細胞系におけるトランスにおけるリガンド-受容体相互作用を迅速かつ半定量的に測定するための最適化されたプロトコルを提示する。
この細胞ベースのアッセイにより、長時間のタンパク質精製や特殊な装置を必要とせずに、トランス接着相互作用の観察と定量が可能になります。ここで検証されたタンパク質相互作用は神経生物学に関連していますが、この方法は、タンパク質の接着が細胞間で起こっている研究のどの分野にも適用できます。HEK-293T細胞をトランスフェクションしてから48時間後、6ウェルプレートから細胞を回収して凝集させます。
まず、PBSで各ウェルを2回洗います。次に、細胞を穏やかに解離するために、各ウェルに1ミリリットルの10ミリモルEDTAを加え、プレートを摂氏37度でインキュベートします。5分間のインキュベーション後、プレートを軽くたたいて細胞を切り離し、各ウェルを別々の15ミリリットルの円錐管に回収します。
チューブを500 x gで室温で5分間遠心分離します。細胞がペレット化されている間に、微量遠心チューブの上部に実験条件をラベル付けして、6本のインキュベーションチューブを準備します。GFPとmCherryのすべての順列を使用する必要があります。
15ミリリットルの円錐管から上清を取り除き、細胞を500マイクロリットルの培地に再懸濁します。血球計算盤を使用して、各円錐管内の細胞をカウントします。次に、各条件から200,000個の細胞を適切なインキュベーションチューブに分注し、総容量500マイクロリットルの1対1の混合物にします。
次のセクションで説明するベースライン凝集を評価した後、インキュベーションチューブを室温で低速のチューブローテーターに入れます。凝集を評価するには、ベースライン時と60分後に、インキュベーションチューブから40マイクロリットルを帯電した顕微鏡スライドにピペットで移します。ベースライン取得は、微量遠心チューブに細胞を添加した後、できるだけ早く行う必要があります。
スライドを蛍光下で緑と赤の両方のチャンネルで画像化します。各スライドで、3つの異なる視野の画像を1つの焦点面にキャプチャします。HEK-293T細胞に目的タンパク質、目的変異タンパク質、または目的リガンドをトランスフェクションし、蛍光タンパク質と同時トランスフェクトしました。
目的のタンパク質を発現する細胞集団を、目的のリガンドを発現する細胞集団と混合し、60分後の凝集を評価しました。緑と赤のチャンネルでキャプチャされた画像のオーバーレイでは、集約は黄色のプンクタとして表示されます。細胞がシナプスリガンドを発現していない条件では、凝集は最小限でした。
また、2つの集団のうち1つだけがシナプスリガンドを発現している場合、最小限の凝集が示されました。細胞の2つの集団が不適合な接着分子を発現した場合、凝集は示されませんでした。適合する接着分子を有する条件は、60分間のインキュベーション後に有意な凝集を示しました。
驚くべきことに、目的の変異タンパク質は、野生型のタンパク質よりも有意に多くの凝集を示し、点変異がタンパク質の結合能力を強化することを示唆しています。多くの接着分子の変異は、一般的に神経発達障害、神経精神障害、および依存症に関連しています。この手法により、疾患に関連する点突然変異がトランス相互作用に及ぼす影響をスクリーニングすることができます。
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概要
本研究では、HEK-293T細胞を用いた蛍光顕微鏡アプローチにより、transでのリガンド-受容体相互作用を迅速かつ半定量的に測定するための最適化されたプロトコルを提示します。本手法により、神経生物学およびその他の研究領域に関連するタンパク質接着相互作用の定量が可能となります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経生物学
- 細胞接着
- タンパク質相互作用
背景
- リガンドと受容体の相互作用は、細胞間コミュニケーションにおいて極めて重要です。
- これらの相互作用を理解することは、神経発達障害や神経精神疾患のメカニズムを解明するのに役立ちます。
- 従来の方法では、大規模なタンパク質精製や特殊な装置が必要となる場合があります。
- 本研究では、蛍光顕微鏡を用いたより効率的なアプローチを提案します。
研究目的
- 細胞ベースのアッセイにおいて、タンパク質接着を研究するための迅速かつ効果的なプロトコルを開発すること。
- タンパク質の点変異がtrans相互作用にどのように影響するかを評価すること。
- この手法を神経生物学以外でのタンパク質接着研究に広く適用すること。
使用された手法
- 細胞間相互作用のイメージングには、蛍光顕微鏡を用いた。
- 生物学的モデルとしてHEK-293T細胞を使用し、導入したタンパク質およびリガンドに着目した。
- 実験スケジュールでは、トランスフェクションから60分後に細胞凝集の評価を行った。
- ヘモサイトメーターを用いて細胞数を算出した後、細胞を再懸濁し、混合してイメージングに供した。
主な結果
- 適合する接着分子を発現する細胞の凝集は、60分後に有意に促進された。
- 変異タンパク質は野生型と比較してより強い凝集を示し、結合能が向上していることが示唆された。
- シナプスリガンドを発現する細胞集団がないか、あるいは一方の集団のみである場合には、凝集はほとんど観察されなかった。
結論
- 本研究では、細胞間の接着相互作用を評価するための簡略化された手法を提示します。
- 本知見は、タンパク質相互作用に対する変異の影響を探索する上での本手法の有用性を強調するものです。
- 本手法から得られる知見は、さまざまな神経発達障害および精神疾患の根底にあるメカニズムを理解するために有用です。
よくある質問
業界における実用的意義
このアッセイでは、細胞内環境におけるトランスタンパク質間相互作用の直接測定が可能となり、シス結合とトランス結合を区別できない生化学的アッセイの主要な限界を解消します。生理学的に関連のある細胞間接着のみを定量化することで、本手法はターゲットバリデーションの信頼性を向上させ、初期探索における偽陽性を減少させます。これにより、神経発達障害および神経精神疾患に関与する接着ターゲットのメカニズム的なリスク低減を支援します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 別々の細胞に発現させたリガンドと受容体のペア間の機能的なトランス接着を測定することで、治療仮説を検証できる。
- 運用的価値： タンパク質精製の必要性を排除し、細胞システム内で変異体やバリアントの迅速なスクリーニングを可能にする。
- 予測的価値： 疾患関連変異による凝集能の向上は、本アッセイが優先順位付けのための機能獲得型バリアントを特定できることを示している。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備状況：蛍光タグ付きHEK細胞を使用することで、ハイスループットスクリーニングへの適応に向けた定量可能なイメージング読み取り値（例：オーバーレイ画像における黄色点状構造）を生成します。
- 再現性：細胞の混合およびインキュベーション条件を標準化することで、実験間で一貫した凝集測定が可能です。
- 拡張性：シンプルな混合およびイメージング手順を用いることで、複数の条件（例：野生型対変異体、リガンドの組み合わせ）の並行したテストをサポートするプロトコルとなっています。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：神経発達障害、神経精神疾患、および依存症で一般的である接着分子の点変異が、trans相互作用にどのように影響するかを直接的に検証します。
- トランスレーショナルな連続性：in vitroの結合アッセイと細胞表現型を橋渡しし、機能的な接着データに基づいたgo/no-go決定を支援します。
- メカニズムによるリスク低減：変異が細胞間結合を増強するか、あるいは阻害するかを特定し、標的メカニズムおよび安全性プロファイルの策定に役立てます。
パイプラインとワークフローの統合
本アッセイは、ターゲットエンゲージメントスクリーニングと機能的バリデーションの中間に位置し、リード最適化および前臨床候補化合物の選定に資する接着特異的なデータを提供します。
- ディスカバリーバイオロジー：遺伝的変異が細胞間接着を変化させるかどうかを検証し、パスウェイの解明およびターゲット仮説の検証をサポートします。
- 分析：定量的なイメージングベースの読み取り値（経時的な凝集体の形成）を生成し、条件間の比較および相互作用強度の評価を行います。
- トランスレーショナルリサーチ：分子レベルの変化を、シナプス形成および神経接続に関連する細胞表現型に結びつけます。
- エンタープライズでの再利用：あらゆる細胞間タンパク質接着システムに適応可能であり、さまざまな治療領域にわたって再利用可能なプラットフォームとなります。
運用および企業への影響
- 科学的価値： trans相互作用のみを測定するため、溶出液ベースのアッセイで見られる結合の過大評価を抑え、ターゲット特異性を向上させます。
- 運用的価値： 標準的な細胞培養と蛍光顕微鏡を使用するため、特殊な装置や複雑な試薬を必要としません。
- 戦略的価値： 変異がターゲット機能に及ぼす影響を迅速に評価でき、リード同定におけるより的確なgo/no-go判断を支援します。
- ポートフォリオへの影響： 効能や毒性に影響を与える可能性のある、接着性が変化した変異体を特定することで、リスク調整後の優先順位付けをサポートします。
実施上の検討事項
- 哺乳類細胞のトランスフェクション、蛍光タンパク質タグ付け、およびフローサイトメトリーまたは血球計算盤を用いた細胞カウントの専門知識が必要です。
- 2チャンネルイメージング機能（例：GFPおよびmCherry）を備えた蛍光顕微鏡と、凝集量を定量化するための画像解析ツールに依存します。
- チーム間で再現性のある凝集読み取り値を確保するために、細胞の発現レベルおよび混合比の標準化が必要です。
- 非HEK系への適応には、トランスフェクション効率および接着分子の表面発現の最適化が必要になる場合があります。
- 接着の評価に限定されており、結合後のダウンストリームシグナリングや内部化イベントについては報告しません。
