定義された分化系を用いた多能性幹細胞からの肝前駆体仕様

このプロトコルは、幹細胞由来の肝臓分化システムを提供し、基礎研究と臨床研究の両方で肝臓生物学を研究するための再現性のあるツールを提供します。標準化された従順なプロトコールと既製の培養試薬を組み合わせることで、このシステムは肝臓前駆細胞や肝細胞様細胞の大規模な生産を可能にします。ラミニン-531の10センチメートル皿でヒト多能性細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%に維持し、皿ごとに10ミリリットルの幹細胞維持培地を毎日与えます。

ラミニン521プレートを調製するには、融解したラミニン521をカルシウムとマグネシウムを含む氷冷DPBSで希釈し、最終濃度を1ミリリットルあたり8マイクログラムにします。24ウェルプレートの各ウェルに250マイクロリットルのラミニン溶液を、または96ウェルプレートの各ウェルに50マイクロリットルを添加します。プレートを左右にそっと揺らしてウェルを均一にコーティングし、プレートを半透明のフレキシブルフィルムでシールし、摂氏4度で一晩保管します。

細胞播種当日は、プレコートしたプレートを細胞培養インキュベーターで30〜60分間温めます。ラミニン521溶液を吸引し、10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した幹細胞維持培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻します。細胞数の流暢さが70〜80%に達したら、培養皿から使用済み培地を吸引し、カルシウムやマグネシウムを含まない5ミリリットルのDPBSで各培養皿を室温で洗浄します。

培養皿からDPBS洗浄液を吸引し、5ミリリットルの酵素を含まない解離試薬を皿に加え、細胞が皿から目に見える形で分離するまで、プレートを摂氏37度で8〜10分間インキュベートします。細胞スクレーパーで培養皿から細胞を静かに分離し、次に5ミリリットルの血清学的ピペットで各ウェルの内容物を上下にピペットで動かし、単一細胞懸濁液を生成します。各細胞株について、すべてのメンテナンスウェルの細胞を滅菌済みの50ミリリットルチューブにプールします。

空にした各培養皿を5ミリリットルのこれらの幹細胞維持培地で洗浄し、プールされた細胞の対応するチューブに洗浄液を追加します。プールされた各サンプルで3つの生細胞カウントを実行します。プールしたサンプルを250 x gで5分間遠心分離します。

次に、上清を吸引し、10マイクロモルのROCK阻害剤Y27632を添加した幹細胞維持培地として、細胞を室温の1〜3ミリリットルに再懸濁します。所望の播種密度を達成するために必要な細胞数を計算した後、細胞を適切な濃度に再懸濁し、プレコートプレートに分注します。ウェルあたりの総容量は、24ウェルプレートで1ミリリットル、96ウェルプレートで0.1ミリリットルである必要があります。

プレートを左右および前後に穏やかに揺らして細胞が均一に分散するようにし、播種したプレートをインキュベーターに入れ、前後左右に揺らします。根治的内胚葉誘導およびその後の肝前駆細胞の特異的分化のための培地を調製します(本文原稿に記載されています)。差別化の1日目に、使用済みの培地をウェルから取り出し、ステージ1の培地と交換します。

2日目、3日目、4日目に、使用済みの培地を取り出し、ステージ1の培地2を各ウェルに供給します。5日目に、決定的な内胚葉分化分析を目的としたウェルを固定します。残りのウェルについては、使用済みの培地を取り出し、各ウェルにステムディフ肝前駆培液を供給します。

10日目に、肝前駆細胞分化解析のために細胞を採取するか、さらに肝細胞様細胞分化を進めます。肝前駆細胞分化培養物の特性を明らかにするには、免疫染色を使用して、5日目に決定的な内胚葉特異的マーカー、10日目に肝前駆細胞特異的マーカーの発現を検出し、HNF4α陽性細胞の割合を定量化します。10日目には、ELISAを介してアルファフェトプロテインとアルブミン分泌も測定します。

このプロトコルは、ヒト胚性幹細胞およびヒト人工多能性幹細胞の両方から肝前駆細胞を分化するために使用されました。分化プロトコルの5日目に、Sox 17発現により決定的な内胚葉仕様を評価しました。両細胞株において、Sox 17は高発現しており、Sox 17陽性細胞のH9およびP106に対してそれぞれ80%および87.8%が陽性でした。

10日目に、肝臓の祖先は丸石のような形態を示しました。さらに、HNF4 α、AFP、アルブミン、およびサイトケラチン 19 の発現について、肝前駆細胞の仕様を評価しました。両方の肝前駆細胞培養物は、HNF4α、AFP、およびCK19などの胎児肝マーカーを発現しました。

アルファフェトタンパク質の分泌は両方の細胞株で10日目に検出されましたが、ELISAではアルブミンの分泌は検出されませんでした。細胞数の変動性と肝前駆細胞の分化効率は、HNF4α発現を定量化することにより評価されました。10日目には、肝臓前駆細胞は列間で有意な変動を示さず、H9およびP106のウェルあたり95および97%を超えるHNF4アルファ陽性細胞

分化開始前に細胞を均一に分布させることは、肝臓前駆細胞の均質な集団を確保するための鍵となります。これを実現するには、プレートを左右および前後に穏やかに揺さぶり、細胞が均一に分散するようにします。このプロトコルで産生された肝前駆細胞は、他のアッセイのために肝細胞様細胞にさらに分化させることができ、疾患モデリングや薬物スクリーニングのための再現性のある標準化されたツールを提供します。