肺環境における免疫細胞および炎症誘発性メディエーターの特性評価

このプロトコルは、虚血性脳卒中後の肺環境の変化を調査するために使用できます。この方法により、フローサイトメトリー解析により、同じマウス内の13種類の肺免疫細胞と13種類のサイトカインおよびケモカインを同定することができます。この方法は、虚血性脳卒中後の肺環境の変化を評価するために利用されています。

ただし、アレルギー反応や感染中の変化を調査するのにも役立ちます。全身経心灌流を行うには、麻酔をかけたマウスでペダルリフレクトに対する反応がないことを確認し、マウスを手術台に固定します。毛皮を70%エタノールで濡らして体腔内への毛皮の分布を減らし、垂直正中線皮膚切開を行って無傷の腹膜を露出させ、胸腔に達するとすぐに切開を停止します。

細かい解剖ハサミを使用して腹膜の正中線切開を行い、胸腔で停止し、鉗子を使用して胸骨の遠位端をつかみます。はさみを使用して、心臓、肺、または血管系に損傷を与えることなく横隔膜を切断します。下にある組織が見えたら、胸郭を切開し、心臓と肺が完全に露出するように肋骨の側面を固定します。

大動脈弓の近くの右心房に小さな切開を慎重に行い、灌流の流出として機能し、25ゲージの針を左心室の遠位上面に迅速かつ穏やかに挿入します。針が所定の位置に配置されたら、10ミリリットルの冷たいPBSを心臓にそっと洗い流します。組織は血液から排出され始めるはずです。

全量が配達されたら、肝臓が薄茶色の外観を示し、肺の色が赤みがかったピンクからほとんど白に変わるまで、冷たいPBSの2番目の10ミリリットルのアリコートを灌流します。鉗子と細かい解剖ハサミを使用して、周囲の組織をすべて慎重に取り除き、肺葉を分離し、1〜2ミリリットルの冷たい肺細胞が入ったシャーレに入れます。マルチプレックスビーズアレイ用の肺組織を調製するには、3つの滅菌2.3ミリリットルジルコニア/シリカビーズを含む2ミリリットルのチューブに200マイクロリットルの冷ホモジナイゼーションバッファーを追加し、目的の肺葉を秤量します。

50〜100ミリグラムの肺組織をビーズと均質化緩衝液の予冷チューブに移し、ビーズベースのホモジナイザーを使用して少なくとも2分間毎分4, 000回転でローブを均質化します。組織が完全に均質化されたら、チューブを遠心分離して組織を沈殿させ、氷上で事前に冷却した1.5ミリリットルのマイクロチューブにスーパー清液を移します。肺組織の解離のために、残りの肺葉から肺細胞培地を慎重にデカントし、25ゲージの針を組織に挿入します。

200〜250マイクロリットルの容量の解離バッファーを各肺葉に注入して、各肺葉が2〜3回注入されるまで肺を膨らませます。室温で2分間インキュベートした後、細かい解剖ハサミを使用して肺を細かく刻み、組織溶液を15ミリリットルのクロニクルチューブに移します。サンプルに6ミリリットルの解離バッファーを追加し、1分間激しくボルテックスします。

次に、組織片を摂氏37度で45分間インキュベートし、7〜8分ごとにボルテックスします。インキュベーションの最後に、サンプルを1分間激しくボルテックスし、サンプルを100ミクロンのセルストレーナーに通して、残存する望ましくない結合組織と間質組織を除去します。遠心分離により組織を採取し、5ミリリットルの冷たい肺培地でペレットに再懸濁します。

サンプルを再度遠心分離し、ペレットを1ミリリットルの冷たい肺培地に再懸濁し、穏やかなボルテックスで行います。次に、カウントする前に100ミクロンのストレーナーで細胞をろ過します。単離された肺組織内の免疫細胞集団を評価するために、96ウェルの丸い底板で適切な数のウェルにセットされた10〜6番目のパワーセル抗体を1〜2倍播種し、遠心分離によって細胞をプレートの底部に配置します。

各ウェルに25マイクロリットルの適切な抗体カクテルを冷たいFACSバッファーで加え、穏やかなパイプペッティングで混合します。20分後、ウェルあたり100マイクロリットルの冷たいFACSバッファーに細胞を再懸濁し、サンプルをチューブあたり150マイクロリットルの追加FACSバッファーを含む個々の5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブに移します。その後、標準的なフローサイトメトリー解析プロトコルに従って、フローサイトメーターでサンプルを直ちに分析します。

この代表的な解析では、5〜7種類の抗体の組み合わせを3セット使用して、肺内の免疫細胞の13の異なる集団を同定しました。死細胞は生死染色を使用して除外し、表にリストされている抗体とマーカーを使用してさまざまな免疫細胞タイプを区別しました。肺胞および間質性マクロファージ、CD103陽性およびCD11B陽性樹状細胞および好酸球をセット1で同定した。

炎症誘発性単球および好中球はセット2で同定され、CD4陽性およびCD8陽性T細胞、B細胞、形質細胞様樹状細胞、NK細胞、およびNKT細胞はセット3で同定されました。生存細胞の総数、CD45陽性細胞の割合、および得られたCD45陽性細胞の総数は、実証されたように単離された細胞集団と、市販の組織解離器を用いて単離された細胞集団とで類似していた。さらに、CD45陽性細胞間の細胞死の割合は、両方のプロトコルで10%未満であり、実証されたプロトコルが自動組織解離器の助けを借りずに高収率、高細胞品質の回復を促進することを示唆しています。

さらに、市販のマルチプレックスアッセイとフローサイトメトリー解析を組み合わせることで、組織1ミリグラムあたりの各サンプル中のケモカイン濃度を決定することができます。コラゲナーゼD濃度、インキュベーション時間、およびシングルセル単離中に使用される温度は、免疫細胞の回復に重大な影響を与えます。