キュレックス・キンケファシアトゥスにおける効率的な部位特異的変異誘発のための胚微小注入技術
2020年5月24日
このプロトコルは、CRISPR/Cas9遺伝子編集ツールで動作するように最適化された Culex quinquefasciatus 胚のマイクロインジェクション手順について説明します。この技術は、この研究対象疾患ベクターの遺伝的技術を構築するために使用できる部位特異的、遺伝性、生殖細胞系列突然変異を効率的に生成することができる。
胚マイクロインジェクション技術は、数多くの遺伝子ベースのベクター制御ツールの開発への道を開いてきました。多くの昆虫種がすでに十分に発達したプロトコルを持っていますが、Culex quinquefasciatusは比較的研究が進んでいません。このマイクロインジェクションプロトコルは、採卵、卵ラフト分離、注入後の手順など、Culex quinquefasciatusのユニークな生物学的特性に対応するように特別に設計されています。
この方法は、関心のある任意のCulex種に適用できる可能性が高く、遺伝子機能の研究やCulex種の遺伝子ベースの制御技術の生成に使用できます。いかだから卵を分けることから始めます。鉗子または絵筆を使用していかだを押し下げ、個々の卵をからかいます。
スライドガラスの上部に敷いた両面粘着テープの薄いストリップに卵を合わせ、各卵の前面を同じ方向に向けて努力します。ハロカーボン試薬を水と穏やかに混合し、25°Cで一晩インキュベートして、ハロカーボン混合物を調製します。整列した卵をハロカーボンオイル混合物で覆います。
マイクロインジェクション用の針を生成するには、製造元の指示に従って、アルミノケイ酸塩キャピラリーガラスをニードルプラーに入れます。.熱を 560 に、速度を 100 に、遅延を 70 に、引っ張りを 97 に、圧力を 500 に設定します。次に、ニードルプラーをアクティブにします。
回転するダイヤモンド砥粒板に引っ張った針の先端に50度の角度で約10秒間そっと触れ、針先を面取りします。引っ張って面取りした針を、ペトリ皿のモデラーの粘土の線に埋め込みます。ゲノム改変試薬からなる注入混合物を調製し、氷上に保存します。
マイクロローダーチップを使用して、2マイクロリットルの注射混合物を注射針に装填します。充填した注射針を電子マイクロインジェクターに連結したマイクロマニピュレーターにセットし、整列卵を並べたスライドガラスを複合顕微鏡のステージに置きます。マイクロマニピュレーターを使用して、針を胚の後端に向けるように25〜35度の角度で合わせます。
針を胚に慎重に挿入し、胚の体積の約10%の量で混合物を注入します。一度に20個の卵子を注入し、その後停止して胚回収手順を実行します。注射後20分以内に、清潔な絵筆で卵を軽くブラッシングして、卵からハロカーボンオイルを慎重に取り除きます。
絵筆で卵を持ち上げ、卵が表面に付着しないように注意しながら、二重蒸留水のカップに入れます。次の7日間は、卵の孵化を毎日チェックし、通常の幼虫の飼育手順に従ってください。ステレオスコープを使用して、突然変異体の表現型について注射された蚊をスクリーニングします。
この方法は、ダークアイ色素の発症に重要な遺伝子の体細胞および生殖細胞変異を成功裏に生成するために使用されてきました。CRISPR-Cas9が生成した体細胞変異は、注射を受けた個人の瞳孔期の眼における色素沈着の喪失をスクリーニングすることによって採点されました。体細胞変異は一般にモザイク表現型として存在し、細胞のすべてではないが一部が変異表現型を有する
。生殖細胞変異率は、モザイクGゼロ個体を交配し、完全に白眼の子孫ごとにスコアリングすることによって決定されました。これらの実験により、胚の生存率は64〜82%、体細胞突然変異誘発率は37〜57%、生殖細胞系突然変異誘発率は61%を超えました。sgRNAをマルチプレックス化して同じ遺伝子の複数の遺伝子座を標的とすることにより、体細胞および生殖細胞系の突然変異誘発率は86%にも増加しました。さらに、何世代にもわたって、白色変異体の生存可能なホモ接合ストックが実験室で成功裏に保持されてきました。
生存率と突然変異誘発率を最適化するために、マイクロインジェクションを試みる前に、ハロカーボンオイル、注射液、針を含むすべての材料を適切に準備する必要があります。これにより、より合理化され、焦点を絞ったマイクロインジェクションプロセスが可能になります。
概要
本プロトコルでは、CRISPR/Cas9ゲノム編集に最適化したCulex quinquefasciatus胚へのマイクロインジェクション技術について概説します。これにより、遺伝学研究や媒介生物制御技術のための、遺伝可能な生殖細胞系列変異を効率的に導入することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 遺伝子工学
- ベクター生物学
- CRISPR/Cas9技術
背景
- Culex quinquefasciatusは、研究が進んでいない疾患媒介生物です。
- 遺伝学的制御ツールの開発において、マイクロインジェクション技術は極めて重要です。
- 他の昆虫種に対する既存のプロトコルは十分に確立されています。
- 本手法は、Culex種の固有の生物学的特性に対応しています。
研究目的
- Culex quinquefasciatusのマイクロインジェクションプロトコルを開発すること。
- 遺伝子機能研究および遺伝的制御技術を促進すること。
- 注入した胚における生存率および変異誘発率を最適化すること。
使用した手法
- 卵の回収およびラフト分離の手法。
- ハロカーボンオイルおよび注入混合液の調製。
- マイクロマニピュレーターを用いた胚へのマイクロインジェクション。
- 注入後の変異表現型のスクリーニング。
主な結果
- 胚の生存率64-82%を達成した。
- 体細胞変異率は37-57%の範囲であった。
- 生殖細胞変異率は61%を超えた。
- sgRNAをマルチプレックス化することで、変異率が86%まで上昇した。
結論
- 本プロトコルにより、体細胞および生殖細胞の変異を効率的に導入することができます。
- 変異体の生存可能なホモ接合体系統がラボ内で維持されました。
- 材料を適切に準備することで、マイクロインジェクションの工程が効率化されます。
よくある質問
産業界における重要性
効率的な胚マイクロインジェクションにより、ウエストナイルウイルスやリンパ系フィラリア症などの疾患の主要な媒介動物であるCulex quinquefasciatusにおける部位特異的変異導入が可能になります。この技術は、機能遺伝子研究のための遺伝性変異を生成することで、初期創薬におけるターゲットバリデーションおよびメカニズムのデリスキングを支援します。本プロトコルは種特有の障壁に対処し、媒介生物制御ターゲットの同定および前臨床モデル開発における予測信頼性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：疾患に関連する昆虫媒介動物において、精密な遺伝子ノックアウトを通じて治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値：病原体伝播に関与するターゲットの機能検証に向けた、生殖細胞系列変異を導入するための再現性のある手法を提供する。
- 予測的価値：遺伝子破壊を媒介能に重要な表現型のアウトカムに結びつけることで、ポートフォリオの優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： ガイドRNAの設計による編集効率を評価するために、定量可能な変異誘発リードアウト（体細胞および生殖細胞系列の速度）を算出します。
- 運用上の価値： 胚の取り扱いと注入条件を標準化し、実験バッチ間でのアッセイの再現性を向上させます。
- 拡張性： マルチプレックスsgRNA導入を可能にして変異誘発速度を高め、ハイスループットなターゲットスクリーニングを支援します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： 遺伝性の白色眼変異体を作製し、長期的な表現型および伝達研究のための安定した遺伝系統を確立する。
- 運用上の価値： 胚の生存率64–82%を達成し、後続の表現型スクリーニングに十分な数の生存可能な変異体を確保する。
- トランスレーショナルな連続性： 世代を超えて生存可能なホモ接合体変異体ストックを維持し、遺伝的制御戦略の前臨床評価を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、十分に研究されていない媒介種における機能ゲノミクスを可能にすることで、標的仮説からリード化合物の同定に至る創薬の探索 continuum に適合します。
- 探索生物学：CRISPR/Cas9による突然変異誘発を介した仮説検証をサポートし、病原体と媒介者の相互作用における遺伝子機能を明らかにします。
- スクリーニング：定量的な突然変異率（体細胞 37–57%、生殖細胞 >61%）を提供し、ガイドRNAの有効性の比較および編集条件の最適化を可能にします。
- 分析：実体顕微鏡によるスクリーニングを通じて変異表現型のスコアリングを可能にし、ヒットの検証に不可欠な測定可能なアウトプットを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：安定した変異系統を構築することで、遺伝子の発見から前臨床モデルの開発までの連続性を促進します。
- 企業での再利用：Culex属の種間で適応可能な標準化されたマイクロインジェクションのワークフローを確立し、冗長なプロトコル開発を削減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ベクトル媒介性疾患モデルにおいて、遺伝子型と表現型の直接的な関連付けを可能にすることで、メカニズムの曖昧さを軽減します。
- 運用の価値：卵の整列、ハロカーボンによる被覆、および針の準備手順を標準化することで、再現性を向上させます。
- 戦略的価値：ベクトルの生存や病原体伝播に不可欠な標的の機能的検証を提供することで、go/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響：遺伝性変異率と表現型の重症度に基づいた、リスク調整済みの標的優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 胚の取り扱い、マイクロマニピュレーション、および蛍光または実体顕微鏡によるスクリーニングの専門知識が必要です。
- 胚の生存率を維持するため、ニードルプラー、マイクロインジェクター、およびハロカーボンオイルの調製に依存します。
- 卵の回収およびラフト分離技術について、チーム間での標準化が必要です。
- Culex属の種間で適応させる場合、注入量やニードルの形状の調整が必要になることがあります。
- 実用上の制限として、胚の脆弱性があること、および生存率を維持するために注入直後のリカバリーが必要であることが挙げられます。
