環境DNA応用に関する種特異的定量PCRアッセイの開発と試験

環境DNAデータを適切に解釈するためには、十分に最適化されたアッセイが不可欠です。このプロトコルでは、このようなアッセイを開発するために必要な設計および試験手順について説明します。一般に、環境DNAは、特定の種または種のスイートを検出するための非侵襲的な方法です。

従来の調査方法に比べてコストを削減し、感度も高くなる可能性があります。この方法は、関心のある種からのDNAの検出を通じて保全と野生生物の管理を支援することができ、サンプリングされた領域にその種が存在する可能性を推測することができます。定量PCRは感度が高いため、コンタミネーションが発生しやすく、コンタミネーションが発生したステップを特定するためにネガティブコントロールが必要です。

eDNAは、専門用語や略語が散りばめられた分野です。分子生物学やqPCRを学んでいない方でも、視覚的なデモンストレーションは、概念化からデータ生成までの実験デザインの計画に役立ちます。この手順を実演するのは、私たちの研究室の生物学者であるDannise Ruiz Ramosと、学生の実験室補助者であるTrudi Frostです。

まず、NCBIのヌクレオチドデータベースを使用して、複数の遺伝子領域から目的の種の配列を検索し、ダウンロードします。仕様に一致するすべてのシーケンスを選択し、[Send To]を選択します。[Complete Record]、[File]、[Download Format]をGenBankまたはFASTAとして選択し、[Create File]を選択します。これらのシーケンスがコンピューターに保存されました。

対象のすべての種について、これらの手順を繰り返します。各遺伝子領域の配列は、別々に解析されるため、別々のファイルに保存してください。各遺伝子領域の配列を個別にアラインメントするには、ダウンロードした配列ファイルをGeneious Primeソフトウェアなどの配列アラインメントプログラムにインポートします。

遺伝子領域ごとに個別のフォルダを作成し、1つの遺伝子領域の配列を含むフォルダ内のすべての配列を選択します。Multiple Alignment(マルチプルアラインメント)ツールを使用して、選択したシーケンスのGeneiousやMUSCLEなどのヌクレオチドアラインメントを作成します。アラインメントされた配列データの可視化により、アッセイ設計に有望な領域を選択します。

対象種について利用可能な配列データが多く、種間の分岐性が高く、種バリエーションが少ない領域を選択します。次に、アッセイプライマーとプローブを設計します。qPCRアッセイ設計ソフトウェアを使用して、5セットのqPCRアッセイを設計します。

選択したシーケンスを「シーケンス入力」ボックスに貼り付けます。線形によってスペースが作成された場合は、シーケンスからそれらを削除します。「Choose Your Design」オプションでqPCR 2プライマープローブを選択し、推奨アッセイをダウンロードしてください。

最初のアッセイのフォワードプライマーから配列をコピーし、以前に作成したアラインメントでこのプライマー配列を検索します。Geneious Primeを使用している場合は、Annotate Predictツールを使用して、プライマー領域をアラインメントに追加します。これは、すべてのプライマーとプローブの組み合わせに対して行います。

対象種内および共起種内でのばらつきがないか調べます。NCBIのPrimer-BLASTを使用して、プライマーをin silicoでテストします。プライマーパラメータの下の私自身のプライマーボックスを使用してプライマーを貼り付けます。

「Primer Pair Specificity Checking Parameters」オプションで、「Database」として「NR」を選択し、「Iolite」ボックスに目的の生物の分類順序またはファミリーを入力します。選択したプライマーが非標的分子種を増幅する可能性が低いことを確認してください。in vitroでアッセイ効率を試験するには、標準曲線を作成し、その曲線の効率と線形範囲を決定します。

標的配列を含む合成DNA標準試料の少なくとも6回の10倍希釈を、1反応あたり約1〜100万コピーで試験します。qPCR ソフトウェアを使用して、各標準の CQ 値を Y 軸にプロットし、初期標準濃度の log base 10 を反応ごとのコピー数で X 軸にプロットします。qPCRソフトウェアは自動的に線形回帰を実行します。

回帰の傾きから効率を計算します。標準曲線にバイアスや性能の低下がないか、効率とR二乗値で測定して目視で検査します。内部ポジティブコントロールを使用して、感度の低下や偽陰性につながる可能性のある実際のフィールドサンプルのPCR阻害をテストします。

各アッセイの検出と定量の限界を決定します。非標的分子種でアッセイを試験して特異性を検証し、IPCマルチプレックスでアッセイが良好に機能することを確認します。感度、特異性、効率が優れたアッセイは、次のステップに進むことができます。

アッセイのin situ試験を行うには、複数の水サンプルを採取し、それらをqPCR用に処理します。定量PCRアッセイを実行し、eDNA濃度と検出頻度を、発生量と存在量の既知の部位の違いと比較します。シーケンシングにより、すべての検出を確認します。

クリンチ川に生息するすべてのUnionidae種の利用可能な配列をダウンロードし、アラインメントしました。複数のアッセイを設計した後、5セットのプライマーとプローブをアラインメントに追加して、視覚的評価を行いました。プライマーセットとプローブセットは、in silicoおよびin vitroで試験しました。

ラボでは、特異性を検証するために、利用可能な27種のDNA抽出物を使用してすべてのアッセイを試験しました。1つのアッセイで、標的種のみを増幅することに成功しました。ここでは、良好な効率とR二乗値で成功したアッセイを示しています。

選択したアッセイのLODとLOQは、どちらも反応あたり5コピーでした。対照的に、効率の悪い標準曲線を生成したアッセイは破棄されました。質の高いqPCRでは、標準希釈液は、濃度の10倍の差ごとに約3.3サイクルの等間隔のサイクル定量値で増幅されます。

qPCRが不十分な場合、標準試料は希釈間のサイクル定量値に不均一な変動を示すことがあります。未知サンプルの IPC 増幅は、ネガティブテンプレート制御 IPC の結果と比較する必要があります。サンプルにインヒビターが存在しない場合、すべての IPC 増幅はプロット内で緊密にグループ化され、サイクル定量値はテンプレートなしコントロールとほぼ同じになります。

アッセイのin situ試験では、位置特定サイトには、淡水産貝の床の底、海岸近くの筋肉床の底、川のベッドの下流100メートル、ストリームのベッドの下流500メートル、および海岸近くのベッドの下流500メートルが含まれていました。環境DNAの定量的PCRアッセイは、侵入種と絶滅危惧種の両方のモニタリングに役立つだけでなく、個々の生物を物理的に捕捉することなく、種検出の空間的および時間的変化の理解を深めることができます。