サッカロミセス・セレビシエ・スプライセソソーム・サブコンプレックスの過渡性インターアクター検出のためのグラフィックスの利用

架橋剤の存在下でグリセロール勾配遠心分離を行うグラジエント固定法は、マルチサブユニット複合体に一過性に結合するタンパク質間の相互作用を同定するのに役立ちます。グリセロールグラジエントでの固定試薬の使用は、沈殿物の形成なしに緩い因子の結合を安定させ、特定のタンパク質とスプライシングされた半複合体との相互作用の同定を可能にします。エンドプロトコルのデモンストレーションは、初めてのユーザーが、書かれたテキストだけでは理解しにくい情報を学ぶのに役立ちます。

酵母全抽出物の調製では、タップタグに融合したスプライシング因子の1つを発現する酵母細胞と、適切なアミノ酸または核酸塩基を補充した1リットルのYおよびBグルコース培地を増殖させます。培養物が1ナノメートルの光学密度に達したら、酵母細胞を500ミリリットルの遠心分離ボトル3本に遠心分離して収集し、1回の洗浄で10ミリリットルの冷滅菌水で細胞を2回洗浄します。2回目の洗浄後、細胞をコールドバッファーAの細胞体積の10分の1に再懸濁し、酵母細胞懸濁液の50マイクロリットル滴を液体窒素で凍結します。

凍結後、凍結細胞ペレットをボールミル装置で20ヘルツで6サイクル、3分間粉砕し、各サイクルの終わりに凍結細胞の容器を液体窒素に浸します。最後のサイクルの後、抽出物を含むチューブを室温の水に入れ、時々振とうします。溶けたら、遠心分離機で抽出物を収集します。

そして、上清が除去されたタンパク質をBCA法で定量します。次に、抽出物のアリコートを液体窒素で急速冷凍し、摂氏マイナス80度で保存します。グリセロールグラジエントを調製するには、架橋剤グルタルアルデヒドの最終濃度0.1%を30%グリセロールおよび緩衝液A溶液に加え、混合して均質化します。

12ミリリットルの遠心分離管に6ミリリットルの冷たい10%グリセロールと緩衝液A溶液を加え、長い針を備えたグラジエントマスターデバイスシリンジを使用して、チューブの底に30%グリセロールグルタルアルデヒド溶液を重ねます。グラジエントマスターデバイスを使用して、メーカーの仕様に従って線形グリセロールグラジエントを作成します。200マイクロリットルの7%グリセロールと緩衝剤Aクッションをグラジエントの上部に慎重に重ねてから、チューブの上部に約2ミリグラムの細胞抽出物を追加します。

グリセロールグラジエント生成後、サンプルを事前に冷却したスイングバケットローターに入れ、遠心分離により抽出物を回収します。各12ミリリットルのサンプルチューブからサンプルを24 500マイクロリットルのフラクションで分注し、ペリスタルティックポンプを使用して40%グリセロール溶液をチューブからフラクションコレクションまで10〜30%の勾配で押し込みます。次に、各画分50マイクロリットルをドットブロット上のニトロセルロースメンブレンに直接ロードし、続いてブロッキングバッファーを添加し、免疫ブロット上のタンパク質を検出するためにCBPに対する一次抗体を使用し、必要に応じて適切な二次抗体を使用します。

架橋剤がない場合、CWC 24はフラクション5と13の間に集中し、約80〜200メガダルトンの錯体に対応します。しかし、架橋剤の存在下では、グラジエント上のCWC 24の位置は、より大きな錯体に対応するグラジエントの下部のフラクションにシフトします。CWC 24の沈降をU5 snRNPサブユニットであるPrp8およびNTCサブユニットの沈降と比較すると、Prp19はCWC 24が同じ画分に集中していることを明らかにします。

しかし、それはスプライソソームと一過性に会合するため、軽い画分にも存在します。興味深いことに、フラクション11とフラクション12は、Prp8と19が集中し始めるフラクションであり、これがBアクト複合体が沈降し始める勾配の部分であることを示唆しています。フラクション11および12のウェスタンブロット分析により、Prp8および19のシグナルは、8%アクリルアミドゲルにほとんど入らない塗抹標本であることが明らかになり、それらが実際に大きな複合体の一部であることが示されています。

CWC 24はフラクション12にも存在しますが、はるかに低い濃度であり、B法複合体への一過性の結合と一致しています。まとめると、これらの結果は、グルタルアルデヒドが一過性因子のスプライシングサブ複合体への結合を安定化するための架橋剤として使用できることを示しています。この方法は、スプライソソームなどの一部の成分と一過性に会合する任意の動的モーターサブユニット複合体の研究に適用できます。