パーキンソン病の遺伝的ラットモデルにおける歩行解析のためのラットウォーカーシステムの適用
2021年1月18日
ここでは、ラットのサイズと重量の増加に対応するためにマウスウォーカー装置を再設計することによって構築されたラットウォーカーシステムについて説明します。このシステムは、フラストレーション全反射(FTIR)、高速ビデオキャプチャ、およびオープンアクセス分析ソフトウェアを使用して、歩行パラメータを追跡および定量化します。
この方法により、歩行パラメータの違いを再現可能に定量化することができる。歩行パラメータは、自由に歩くげっ歯類で評価することができ、この技術は、足をインクに浸すなどの侵襲的なステップに依存しません。手順を実演するのはベン・ランバーティです。
各ランニングの開始前に歩道の端にホームケージを配置することから始めて、ラットが歩道を横断するための前向きな手がかりとして機能します。部屋の明かりを消します。カメラの電源を入れ、ラットがプラットフォームに配置される数秒前に録画を開始します。
エンクロージャーを取り付けたら、ラットを歩道の端、ホームケージの反対側に置き、強制せずに歩道を横切って歩けるようにします。動物が歩道の終点に到達したら、記録を停止します。ランニングの合間や動物の排尿や排便後に、70%エタノールと非研磨性のタオルを使用して歩道を掃除します。
次に、別の動物を導入する前にエタノールを蒸発させます。各観察期間中にラットを歩道に合計7回走らせ、最初の3回の実行を分析の合格として採点します。動物がグルーミング、一時停止、または誤った動きのために中断することなく、ホームケージの方向に4つ以上の連続したステップを行った場合、ランをパスとしてスコアリングします。
歩行分析は、運動学的歩行分析の使用が肉眼的運動障害の出現前に微妙な運動障害を発見できるかどうかを決定するために、生後2か月の雄の野生型およびパーキンDKOラットで実施されました。DKOラットの体重が増加したにもかかわらず、歩行面に加えられた足圧は変化しなかった。歩行速度の関数としていくつかの歩行パラメータを評価したところ、歩行速度と歩幅は野生型ラットとDKOラットの間で類似していることがわかりました。
野生型ラットとDKOラットの変動は、歩行速度が遅い場合の立脚期とスイング時間で明らかになりました。脚が立脚段階にあるステップサイクルの割合がデューティファクターでした。デューティファクターが減少するにつれて、スタンスフェーズよりもスイングフェーズでより多くの時間が費やされました。
さらに、野生型動物ではスイング速度が速度の増加とともに増加しましたが、DKOラットでは相関関係が鈍化しました。FTIR歩行分析は、自由に歩くラットの体に対する各脚の立脚位相痕跡のプロットを作成するためにも使用されました。足の位置を比較すると、AEPとPEPに有意な変化が観察されました。
いくつかの追加のパラメータは、野生型と比較してDKOラットにおいて有意に変化した。DKOラットでは左右後肢のスイング速度が上昇し、左右後肢のスイング持続時間は減少した。RatWalkerに関連するカメラ位置を含む機器の一貫したセットアップは、このプロトコルの実装を成功させるために重要です。
このプロトコルを実行した後、動物は、必要な追加の行動または実験エンドポイントに利用可能である。例えば、歩行の変化は組織学的変化と相関し得る。この手法は、不安やうつ病のモデルなど、他の非PDげっ歯類モデルにおける歩行を評価するために使用できます。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本研究では、フラストレイテッド全反射（FTIR）と高速ビデオキャプチャを用いて、自由に歩行するラットの歩行を解析するために設計されたRatWalkerシステムを提示します。本システムにより、歩行パラメータの精密な定量化が可能となり、特に遺伝子改変Parkin DKOラットにおける運動障害に関する知見が得られます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 行動解析
- 歩行評価
背景
- 齧歯類の歩行解析は、一般的に侵襲的な手法に依存しています。
- 先行研究により、運動機能を評価するための非侵襲的技術の向上が必要であることが示されました。
- RatWalkerは、より大型の齧歯類に適応させるためにMouseWalkerシステムを改良したものです。
- 本システムは、明らかな症状が現れる前のわずかな運動機能低下の特定に役立ちます。
研究目的
- ラットにおける非侵襲的な歩行分析手法を開発すること。
- 野生型ラットとParkin DKOラットの歩行の違いを調査すること。
- 複数回の試行にわたって歩行パラメータを追跡するための信頼性の高いプロトコルを確立すること。
使用した手法
- 自由歩行ラットの歩行分析にはRatWalkerシステムが利用された。
- 生体モデルとして、2か月齢の野生型およびParkin DKOの雄ラットを用いた。
- 本研究において、マルチオミクスワークフローに関する言及はなかった。
- ラットはウォークウェイを計7回歩行し、連続したステップに基づいてスコアリングを行った。
- 歩行パラメータは、FTIRおよびビデオ解析を用いて定量化した。
主要な結果
- 歩行分析により、低速走行時におけるDKOラットの立脚相および遊脚時間の有意な差が明らかになった。
- 歩行速度は同程度であったが、野生型ラットと比較してDKOラットでは時間的な歩行パラメータに変化が見られた。
- DKOラットにおいて、足の配置および遊脚速度の重要な変化が観察された。
- 本研究は、信頼性の高い結果を得るための装置の一貫性の重要性を強調している。
結論
- RatWalkerシステムにより、非侵襲的な歩行分析が可能となり、さまざまなげっ歯類モデルへの幅広い応用が期待されます。
- 本知見は、疾患の遺伝的モデルにおける運動機能障害の理解に寄与します。
- 本手法は、さまざまな神経学的状態に関連する歩行障害の調査への応用が可能です。
よくある質問
産業上の重要性
遺伝子モデルにおける軽微な運動機能障害の早期検出は、神経変性疾患プログラムにおける標的の妥当性確認およびメカニズムのリスク低減を支援します。RatWalkerシステムは、非侵襲的で定量的な歩行分析を可能にし、粗大な運動欠損が現れる前の表現型変化を特定できるため、前臨床スクリーニングにおける予測の信頼性を向上させます。このアプローチは、パーキンソン病モデルにおける機能低下の変換可能なバイオマーカーを提供することで、治療候補薬の優先順位付けに寄与します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値： パーキンソン病のラット遺伝子モデルにおいて歩行パラメータを定量化することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： 自由歩行するげっ歯類の運動機能を再現性高く評価することで、生物学的リスクの低減を支援する。
- 予測的価値： 早期の表現型特性評価を促進し、ターゲットへの信頼度の判断およびポートフォリオの選別決定に情報を供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 比較分析に向けた、立脚相、遊脚時間、および足の位置を含む、定量的で高解像度な歩行データを生成します。
- 運用的価値： アッセイ開発や化合物スクリーニングキャンペーンに適した、標準化され拡張可能なリードアウトを提供します。
- 再現性： 試験間およびラボ間で信頼性の高いデータを確保するため、一貫した装置のセットアップとスコアリング基準が必要です。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性： 歩行の変化と組織学的エンドポイントを相関させることで、行動学的所見と神経病理学的所見を橋渡しします。
- 疾患に関連したシステム： 遺伝性パーキンソン病における、明白な症状が現れる前の初期段階の運動機能障害をモデル化します。
- メカニズムによるリスク低減： Parkin/Pink1欠損モデルにおいて、潜在的な神経病理を反映する歩行ベースのバイオマーカーを特定します。
パイプラインおよびワークフローの統合
RatWalkerシステムは、ターゲットバリデーションからリード化合物の特定、そして前臨床薬効試験に至る創薬の連続的なプロセスに適合し、研究の各フェーズにおいて運動表現型の反復的な評価を可能にします。
- 探索生物学：遺伝子モデルにおける歩行障害を測定することで仮説検証をサポートし、ターゲットへの結合およびパスウェイ調節を検証します。
- スクリーニング：げっ歯類モデルにおける運動機能への治療効果を評価するための、アッセイにそのまま利用可能な定量的アウトプットを提供します。
- 分析：デューティファクター、スイング速度、歩行対称性などのキネマティックパラメータを提供し、遺伝子型間の客観的な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：歩行の変化を神経変性マーカーと相関させることで、バイオマーカーの整合性の確認と病態生理学的知見の獲得を支援します。
- 企業での再利用：パーキンソン病以外の複数の神経疾患モデルに適用可能な、拡張性のある非侵襲的プラットフォームを提示します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：臨床的な前駆症状を反映する早期の運動障害を検出することで、予測の信頼性を高める。
- 運用的価値：標準化された歩行経路の横断、スコアリングしきい値、および環境制御を通じて、再現性を向上させる。
- 戦略的価値：前臨床開発における後期段階の表現型リードアウトへの依存を減らすことで、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：治療薬スクリーニングに対する構成概念妥当性を持つモデルを特定することで、リスク調整済みの開発推進を可能にする。
実施上の考慮事項
- 適切なセットアップおよび解釈には、行動神経科学およびビデオベースの動作解析に関する専門知識が必要です。
- ばらつきを最小限に抑えるため、一貫したカメラ位置、照明条件、および歩行路の衛生状態に依存します。
- データの比較可能性を確保するため、ランのスコアリング基準（例：4歩の連続歩行）についてチーム間の合意が必要です。
- 本システムを他のげっ歯類モデルや系統に適応させる際は、種特有の移動パターンを考慮しなければなりません。
- 評価は時間的および空間的な歩行パラメータに限定されており、補完的な手法を用いない限り、複雑な移動シーケンスや詳細な肢のキネマティクスを捉えることはできません。
