自動画像解析を用いたげっ歯類モデルのサブスタチングニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン密度の半定量的決定
2021年2月2日
ここでは、ラットの実質的なニグラ・パルス・コンパクでのドーパミン作動性ニューロン数の半定量的決定のための自動化された方法を提示する。
実質的なニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン数の推定は、パーキンソン病研究における重要な結果尺度である。このプロトコルは、ニューロン数の推定に必要な作業負荷を大幅に短縮します。この方法は、ドーパミン作動性ニューロン数の変化を検出するための時間効率の良い正確なプロセスを提供し、細胞生存に対する介入の影響を決定するのに適している。
この方法は、従来のステレオロジー方法よりもコストと時間の利点を維持しながら、異なる脳領域のニューロンの正確なカウントを提供するために簡単に適応することができます。IHC画像をキャプチャするには、ソフトウェアを10倍倍で共焦点顕微鏡に結合します。ピンホールを1.5の面積単位に開き、合計1.5マイクロメートルの広い平面を捕獲し、脳の注入された側面に焦点を当てます。
取得タブで、タイル スキャン イメージング オプションをオンにし、寸法を 10 ずつ 4 に設定します。取得モードパネルでは、タイルスキャン画像間のステッチマークを避けるために、ズームを1.1に設定します。フレームサイズを1024 x 1024ピクセルに設定し、平均を2に設定して、高品質の画像取得を確実にします。
チャンネルパネルでは、Alexa 488にトラック1を設定し、Alexa 555に2をトラックします。ステージにスライドをロードし、強いTH染色のセクションを選択します。取得パネルでライブをクリックします。
チャンネルパネルで、レーザー強度とゲインを信号を最大化し、バックグラウンドノイズを制限するレベルに設定します。範囲インジケータを使用して、シグナルが過度に露出しないようにします。複数のスライドでこの操作を繰り返します。
取得タブで、ポジションボックスをオンにします。イメージングを開始するには、アイピースを使用し、正のTH染色を示す最初のセクションを選択します。次に、対象のポイントにフォーカスを設定し、ステージをセクションの中線に移動します。
これにより、X、Y、Z 軸の位置が保存され、セクション全体をキャプチャするタイル スキャンがイメージ化されます。この手順は、挿入されていないサイトを含む他のすべてのスライドに対して繰り返します。適切なソフトウェアを使用して画像ファイルを分離し、それらを自動画像解析ソフトウェアにインポートします。
ペン注釈ツールを選択して、実質的なニグラパースコンプッサの周りに注釈を描画することで、対象領域を定義します。[解析] タブに移動し、ドロップダウン分析メニューからリアルタイムチューニングを選択します。これにより、断面イメージ上に別のウィンドウが開き、解析パラメータをリアルタイムで変更できます。
解析の倍率セクションで、適切な画像ズームを選択します。細胞検出部の下でTH染色に使用する色素として核染料を選択します。タイムチューニングウィンドウを注意深く見ながら、核コントラストの閾値、最小核強度、核セグメンテーションの攻撃性、核サイズの設定を調整します。
このプロセスを複数のサンプルで繰り返します。適切な数の画像をサンプリングし、リアルタイムチューニングを調整したら、設定アクションドロップダウンメニューの分析設定を保存します。分析するすべての画像を選択し、分析をクリックします。
保存した解析設定を選択し、解析ウィンドウの領域で[アノテーション レイヤー]ボックスをオンにして、レイヤー 1 をオンにして[解析]をクリックします。オブジェクト分析データをエクスポートするオプションを選択して、すべてのセクションのサマリー分析データをエクスポートします。このデータセットは、毒素または治療に応答して細胞サイズの変化を調べるために使用することができる。
アデノ関連ウイルスまたはAAV注射の6週間後、ラット脳内の実質的なニグラに変異体A53T αシヌクレインを発現するAAVの定位注射はドーパミン作動性ニューロンの密度の有意な減少をもたらした。AAV-A35Tを注射したラットの実質的なニグラで2乗当たりのTH陽性ニューロンの数は、AAV空のベクターを注射したラットのそれと比較して有意に減少した。同様の観察は、公平なステレロジーを用いて行われた。
このプロトコルを試みるとき、ソフトウェアは、それが訓練されているのと同じくらい有用であることを覚えておいてください。したがって、単一のセルが単一のセルとして識別されるように、時間と注意を払う必要があります。このソフトウェアは、α-シヌクレインなどの興味のある他のタンパク質の蛍光強度を測定し、治療がタンパク質レベルを調節できるかどうかを判断するように調整することができます。
この技術は、ドーパミン作動性ニューロン密度に対する複数の潜在的な治療の効果をテストするときの効率を高くすることができました.
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概要
本記事では、前臨床のパーキンソン病研究における重要な指標である、黒質におけるドパミン作動性ニューロン数の推定のための効率的なプロトコルを紹介します。この手法は、自動画像解析を利用してチロシン水酸化酵素（TH）陽性ニューロンの正確かつタイムエフィシェントな定量化を可能にし、従来の不偏立体学的計数法に代わる実用的な選択肢を提供します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- パーキンソン病研究
- 定量組織学
背景
- ドパミン作動性ニューロン数の正確な推定は、パーキンソン病モデルにおける神経変性を評価するために不可欠である。
- 不偏ステレオロジーによる計数は現在のゴールドスタンダードであるが、多大な労力と時間を要する。
- ニューロン定量化のための、効率的で信頼性の高い代替手法が必要とされている。
- 自動画像解析プラットフォームにより、これらの制限を解消できる可能性がある。
研究目的
- ラット黒質におけるドパミン作動性ニューロンの自動画像解析による定量プロトコルの手順を記述すること。
- 本手法を、従来の不偏立体学的手法を用いて検証すること。
- 変異型α-シヌクレインの発現によるニューロン脱落を検出する本手法の能力を実証すること。
使用方法
- ラット脳切片におけるTH標識の免疫組織化学 (IHC)。
- タイルスキャン撮影を用いた10倍率での共焦点顕微鏡イメージング。
- 注釈付き関心領域内の細胞検出および定量化のための自動画像解析ソフトウェア。
- 正確な単一細胞同定のためのパラメータ最適化、およびさらなる解析のためのデータエクスポート。
主な結果
- 自動画像解析法により、黒質におけるTH陽性ニューロン数が正確に推定されました。
- AAVを介した変異型A53T α-シヌクレインの発現後、ドーパミン作動性ニューロン密度の有意な減少が検出されました。
- 結果は、非偏向的なステレオロジー法によるカウントで得られた結果と一致していました。
- 本手法により、複数のサンプルおよび介入の効率的な評価が可能となりました。
結論
- 本プロトコールは、ドーパミン作動性ニューロンを定量化するためのステレオロジーに代わる、時間効率が高く正確な手法を提供します。
- 他の脳領域やタンパク質マーカーにも適用可能です。
- このアプローチにより、前臨床モデルにおける治療的介入の迅速な評価が可能になります。
よくある質問
業界における重要性
黒質におけるドパミン作動性ニューロン密度の正確な定量化は、パーキンソン病の前臨床研究および治療評価において極めて重要です。自動画像解析は、従来のステレオロジーに代わるスケーラブルで時間効率の高い手法を提供し、神経保護介入の迅速な評価を可能にします。このアプローチは、堅牢なターゲットバリデーションをサポートし、創薬の重要な転換点における意思決定を加速させます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 疾患関連モデルにおける神経細胞の脱落または保護の定量的評価を可能にします。
- 細胞生存に対する介入効果を測定することで、治療標的の機能的な検証をサポートします。
- 客観的で再現性のある神経細胞数を提示することにより、メカニズム的なリスク低減（de-risking）を促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 化合物スクリーニングワークフローに向けた、検証済みの脳領域アッセイを調製します。
- ニューロンの定量化を標準化し、再現性とアッセイ間の比較可能性を向上させます。
- 複数の介入に対するハイスループット評価に適した定量的アウトプットを提供します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 前臨床のリードアウトを疾患に関連するエンドポイントと整合させ、トランスレーショナルな連続性を確保します。
- 堅牢な神経細胞生存データに基づいた、リスク調整後の進展決定を可能にします。
- 神経細胞数のカウントと併せてタンパク質発現の変化を定量化することで、バイオマーカー開発を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この自動定量法は、初期段階の探索から前臨床検証までを統合し、標的バリデーション、スクリーニング、およびトランスレーショナルリサーチの各フェーズを橋渡しします。
- 探索生物学： 仮説検証およびパスウェイ解析のための客観的なニューロン密度の測定値を提供します。
- スクリーニング： 化合物の評価およびアッセイ開発に向けた、再現性と拡張性のある定量化を可能にします。
- 分析： 実験条件の統計的比較に使用可能な、エクスポート形式のデータセットを生成します。
- トランスレーショナルリサーチ： パイプライン全体を通じて、疾患に関連するエンドポイントの連続性を維持します。
- 企業内での再利用： 他の脳領域やタンパク質マーカーへの適応が可能であり、幅広いR&Dアプリケーションをサポートします。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 神経変性疾患研究における予測の信頼性を向上させ、メカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用の価値： 自動化によってワークフローを効率化し、スループットと再現性を向上させます。
- 戦略的価値： より迅速なゴー/ノーゴー判定と、より効率的なリソース配分を可能にします。
- ポートフォリオへの影響： 強固な定量データに基づき、リスク調整された治療候補物質の優先順位付けを支援します。
実施上の注意点
- 共焦点イメージングおよび画像解析パラメータの最適化に関する専門知識が必要です。
- 互換性のある顕微鏡および自動解析ソフトウェアのインフラへのアクセスが必要です。
- イメージングおよび解析プロトコルの、チーム間での慎重な標準化が求められます。
- 適切なバリデーションを行うことで、異なる脳領域や標的タンパク質への適応が可能です。
- 精度は、単一細胞識別のための解析ソフトウェアに対する厳格なトレーニングとチューニングに依存します。
