コンピューター断層撮影ベースの3次元可視化のサンプル調製
2021年10月7日
ここでは、マイクロX線コンピュータ断層撮影を用いたマウス後肢血管の可視化と定量方法について述べている。
ステッププロトコルを使用して下肢および腹部器官の血管のCT画像を撮ることは可能である。この方法により、血管全体を総合的に評価することができます。また、動脈のみ、あるいは同時に、動脈と静脈を評価することが可能である。
血栓を防ぎ、漏れたり、血液をうまく漏らしたり、気泡を避けることは非常に重要です。操作の前に、マウスの腹腔内腔にPBSで1単位/グラムのヘパリンを注入する。30分後、安楽死させたマウスの胸骨に正中線切開を行い、開いた胸郭をピンで固定します。
心臓を取り除く前に上昇大オルタを切り、肺を取り除いて下降大根を露出させる。下降大動脈を斜めに切り、船の断面を明らかにします。次に、血管拡張バッファーを実行しながら、22ゲージのカテーテルを下方大陸に挿入します。
カテーテルの根をピン留めし、逆流による漏れを防ぐために結び目を作ります。完了したら、13〜15キロパスカルの間の固定圧力で温めた血管拡張溶液で灌流を開始します。3分後、4%パラホルムアルデヒドの溶液をPBSに3分間浸透させます。
灌流を停止し、カテーテルに接続された延長管を、1:1の比率で希釈した新たに調製したコントラスト媒体の2mLで13〜15キロパスカルの間の固定で浸透する。動脈を可視化するには、口の足の爪を調べて、コントラスト媒体が動脈に到達したことを確認する。同様に、ダイヤフラムの下の大静脈をチェックして、造影剤の完全な循環を確認し、すべての血管を可視化します。
コントラスト媒体の循環が完了したら、三方向栓を閉じてチューブを取り外します。摂氏4度で一晩サンプルをインキュベートします。このプロトコルでは、マウスの下肢にあるすべての血管を可視化した。
後肢虚血モデルの結果は、非結紮大腿動脈が大腿静脈と平行に走っていることを確認した。また、コントラストメディアの中断により、結紮された大腿動脈や副次血管の発達が容易に見えやすかった。対照培地で満たされたいくつかの容器を見ることができる。
一方、非造影媒体の混合による造影媒体の破壊、または不十分な灌流も注目された。対照培地の立体顕微鏡観察の顕微鏡観察によって身体表面の動脈を見ることは不可能であり、血管構造の欠陥を評価しやすくなった。カテーテルを挿入する際には気泡を避けることは非常に重要です。
腹部の臓器もリラックスしているので、臓器から取り出してCTスキャンを行うことができます。この方法を使用することで、新しい4分の1の飽和を特定することができました。
概要
本記事では、マイクロX線計算機断層撮影（micro-CT）を用いてマウスの後肢血管を可視化および定量化する方法について解説します。この手法により、下肢および腹部臓器の血管を包括的に評価することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 血管生物学
- イメージング技術
背景
- マイクロX線コンピュータ断層撮影は、強力なイメージングツールです。
- 血管構造の把握は、さまざまな生物学的研究において極めて重要です。
- 従来の手法では、包括的な可視化が困難な場合がありました。
- 本研究は、マウスモデルにおける可視化技術の向上を目的としています。
研究目的
- 後肢血管を可視化するための信頼性の高い手法を開発すること。
- マウスモデルにおける血管構造の定量化を可能にすること。
- 介入が血管の健康状態に及ぼす影響を評価すること。
使用された手法
- 血液凝固を防ぐためのヘパリンの注入。
- 血管を可視化するための造影剤の灌流。
- 詳細な血管構造を捉えるためのCTイメージング。
- 後肢における動脈と静脈の両方の評価。
主な結果
- 下肢のすべての血管の可視化に成功した。
- 後肢虚血モデルにおける側副路の同定。
- 気泡の混入および不完全な灌流による課題が認められた。
- 本手法により、血管欠損の評価が可能となった。
結論
- 本手法は、血管イメージングに対する包括的なアプローチを提供します。
- マウスモデルにおける血管の状態に関する理解を深めることが可能です。
- 今後の応用として、血管の健康および疾患に関する研究などが考えられます。
よくある質問
産業上の重要性
本手法は、マウスの血管ネットワークの包括的な3D可視化を可能にし、血管新生反応および血管病理の前臨床評価を支援します。後肢および腹部臓器の血管系から定量的な構造データを提供することで、血管生物学および虚血性疾患モデルにおける標的バリデーションを強化します。本技術は、2D切片への依存度を下げ、血管構造や側副路形成の直接的な観察を可能にすることで、リード化合物同定における予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：虚血モデルにおける血管新生および血管リモデリングに関する治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：灌流不全および側副路の発達を直接3Dイメージングすることで、血管標的の機能的な検証を提供する。
- 予測的価値：薬理学的または遺伝学的介入に対する血管反応を定量化することで、ポートフォリオの優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備：ベースラインの血管形態を確立することにより、ダウンストリームの化合物スクリーニングに向けた標準化された生物学的システムを準備します。
- 定量的出力：アッセイの標準化のため、血管密度、分岐パターン、灌流の完全性などの測定可能な血管パラメータを提供します。
- 拡張性：micro-CTプラットフォームと互換性があり、異なる研究室や研究施設間での再現性のあるイメージングを可能にします。
翻訳・前臨床研究
- 疾患への関連性： 後肢虚血における生理学的および病理学的な血管新生をモデル化し、トランスレーショナルなバイオマーカーの整合性を支援します。
- 前臨床の継続性： 縦的な血管評価を可能にすることで、探索的知見と前臨床検証を橋渡しします。
- リスク調整後の意思決定： 血管欠損や薬効に影響を与える代償機構を可視化し、go/no-go基準の判断に情報を供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、創薬から前臨床に至る連続的なプロセスに適合し、特に血管表現型が重要な指標となるターゲット検証およびリード最適化の段階において有用です。
- 発見生物学：疾患モデルにおける血管新生経路および血管整合性の仮説検証を支援します。
- スクリーニング：化合物評価のために、再現性のある定量的なイメージング出力を備えた、アッセイ準備完了済みの血管モデルを可能にします。
- 分析：構造および灌流に基づくリードアウトを提供し、異なる実験条件間の比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：前臨床モデルにおける分子レベルの知見を血管系の結果に結びつけ、バイオマーカーに関連した有効性評価を支援します。
- エンタープライズ再利用：複数の治療領域にわたる血管表現型解析のための、再利用可能なイメージングプラットフォームを確立します。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値：血管反応におけるメカニズム的な曖昧さを低減することで、標的バリデーションにおける予測の信頼性を向上させる。
- 運用の価値：標準化された灌流およびイメージングプロトコルを通じて、再現性と標準化を強化する。
- 戦略的価値：血管系のリスクを早期に検出することを可能にし、後期段階での脱落を減少させることで、資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響：定量的な血管形態および灌流データに基づいた、リスク調整後の推進決定を促進する。
実施上の検討事項
- マイクロサージャリーによる血管灌流および造影剤の取り扱いの専門知識が必要です。
- マイクロCTイメージングのインフラと造影剤の調製能力に依存します。
- 再現性のある結果を得るためには、灌流圧、タイミング、および造影剤の希釈についてチーム間での標準化が必要です。
- モデルシステム間で適応させる場合、カニュレーション技術や灌流パラメータの調整が必要になる場合があります。
- 実用上の制限として、気泡への敏感さ、不完全な灌流、造影剤の混和などが挙げられ、これらは可視化の質を低下させる可能性があります。
