室温でのオンチップ結晶化と大規模シリアル回折

このプロトコルは、X線回折データリコレクションにおけるチップ様デバイス上でのタンパク質結晶化を実証します。このデバイスは、タンパク質結晶が単一の水晶振動子上で成長するため、結晶オンクリスタルと呼ばれます。このようなデバイス上でタンパク質結晶の成長に成功すると、タンパク質結晶に触れることなく、室温で各デバイスから数千の回折画像が収集されます。

室温でのX線回折は、多くの立体構造状態を含むタンパク質の機能を研究するために非常に重要です。この有益なタンパク質変化またはタンパク質作用は凍結できるため、クライオ結晶学では検出できません。このデバイスは、光誘起シグナル伝達プロセスと酸化還元変化の研究に使用できます。

完全で冗長なデータセットを提供するデバイスはほんの一握りです。デバイスの事前組み立てを開始するには、サンプル識別のために外輪にラベルを付けます。必要に応じて、プロジェクト名、デバイス番号、結晶化条件、および日付を含めます。

次に、ラベルの付いたリングを逆さまにしてきれいな表面に置き、外側のリングの内側に1枚の石英ウェーハを置きます。次に、少量の顕微鏡浸漬オイルをペトリ皿に注ぎ、シムの両面がしっかりとコーティングされていることを確認します。きれいな表面にシムを軽くたたくことで、余分な油を取り除きます。

次に、油を塗ったシムを最初の石英ウェーハの上に置きます。タンパク質溶液と結晶化バッファーをピペットを用いて第1の石英ウェーハ上で混合する。混合するときは気泡を避けてください。

結晶化溶液の総容量は、シムのサイズと厚さによって決定される結晶化チャンバーの最大容量を超えてはなりません。2枚目の石英ウェーハを混合溶液の上に置きます。解決策は自然に広がります。

次に、2番目の石英ウェーハの端を軽くたたいて、空気を押し出しながらオイルを広げます。保持リングを外輪にねじ込んでデバイスを固定します。必要に応じて、締め付け工具を使用してください。

締めすぎは、デリケートな石英ウェーハの変形や亀裂の原因となる可能性があるため、避けてください。組み立てたデバイスは、室温の箱または温度管理されたインキュベーター内に保管してください。数時間または数日後、結晶化装置を顕微鏡下に置き、結晶成長を監視します。

必要に応じて、原稿に記載されているように結晶化条件を最適化します。キャリブレーションを行うには、チップホルダーに薄いYAG結晶を取り付けてから、ビームストップを取り付けます。次に、Insituxソフトウェアを開き、指定されたプログラムを実行して、デバイスが結晶化デバイスおよびデバイスのユーザーが選択した名前であるダイレクトビームの蛍光X線画像を撮影します。

param は、デバイス固有の制御パラメーターを含むファイル名です。次に、ビームプロファイルフィッティングプログラムを実行して、直接X線ビームの正確な位置を見つけます (バーン画像は蛍光X線画像のファイル名です)。光学スキャンの場合は、結晶化デバイスをチップホルダーに入れ、つまみネジを使用して固定します。

次に、チップホルダーを運動学的メカニズムを介して回折計の平行移動ステージに取り付けます。タンパク質サンプルの光感度と実験の目的に応じて、白色または赤外線光源を設置して、デバイスの光学窓から顕微鏡写真を撮影します。セットアップの準備ができたら、ビームラインで動いているスキャンのために示されたコマンドを入力してスキャンプログラムを実行します。

次に、ユーザーのコンピューターでタイリングプログラムを実行します(xは列の初期値、yは顕微鏡写真の不正な変位の初期値です)。このプログラムは、すべての顕微鏡写真を1〜3マイクロメートルのピクセル解像度のモンタージュにステッチします。顕微鏡写真をステッチした後、示されたコマンドを入力して結晶検出プログラムを実行します。

このプログラムは水晶認識とショットプランニングを実行し、このプログラムの主要なパラメータは特定のクリスタル選択とターゲットプランニングを可能にします。光源を取り外し、ビームストップを配置します。次に、シリアル回折のデータ収集プログラムを実行します。

提案されたコマンドは、事前にプログラムされた順序で計画されたショットにアクセスすることにより、データ収集をトリガーします。ターゲットとなる各結晶は、ビーム位置に転座します。各停止で、X線被曝は、スケジュールされた時間遅延でレーザー照明の有無にかかわらず行われます。

この研究では、蒸気拡散とオンチップバッチの間の結晶化条件を比較しました。ここでは、オンチップ結晶化の4つのケーススタディと、水晶デバイスから直接収集された代表的なデータセットを示します。動的結晶構造解析実験は、暗所での4, 352個の結晶と光照射後の8, 287個の結晶からのデータを比較することにより、遠赤色光受容体タンパク質の光誘発変化を明らかにした。

in situシリアルラウエ回折からのダークデータセットは、よりよく分解された電子密度をもたらし、すべてのZサイン立体配座におけるビリン発色団の自信を持ってモデル構築を可能にしました。光誘起差分マップは、発色団のピロール環といくつかの芳香族残基との間のπ-πスタックの重要性を示唆する中央ベータシートの協調運動を明らかにした。このプラットフォームはInsituxと呼ばれています。

このプラットフォームのユニークな利点は、結晶化が完了したら結晶操作を行う必要がないことです。タンパク質の動きを捉えるためには、変化する条件下で多くのデータセットを収集する必要があります。そして、これは室温で何千ものタンパク質結晶から大規模なデータ収集を可能にするため、Insituxで可能になります。

結晶学を含むこの新しい機能により、光に敏感なシステムをデバイス内でトリガーし、クリスタルオンクリスタルデバイスが流出に変換された場合に光不活性システムを研究することができます。