ショウジョウバエの幼虫の匂い駆動型の動作の高分解能測定

こんにちは。私はマット・ルイです。ロックフェラー大学のレスリー・サル研究室で博士研究員を務めています。本日は、私たちが幼虫の化学走性を研究するために行っている実験についてお話しします。

私たちが関心を寄せている問題は、非常に単純なものです。実際、ここにあるセットアップで示されています。アガロースの表面に、ショウジョウバエの幼虫のグループを移動させたところです。

この環境はかなり過酷であり、彼らは飢餓状態に近くなっています。これらの動物は、どうにかして最寄りの餌源まで辿り着く必要があります。ここには幼虫を誘引する臭いを放つバナナがあります。この環境は化学走性の挙動を研究するのに理想的ではないため、最初の改善策として、バナナを化学物質に置き換えます。

この化学物質は酢酸イソアミルであり、バナナに多く含まれる香料の一つです。これを作為的な香料として使用することで、嗅覚刺激をより高度に制御することが可能になります。次の改善点としては、密閉環境を使用し、その他の分布における変動を防止することです。

ここでは、私たちの研究室で長年使用しているアッセイについて説明します。これは底面にアガー（寒天）の表面を持つペトリ皿です。アガーは幼虫を湿潤状態に保つことができるため、化学走性を調べるのに最適です。

プレートの両側にはテフロン製のキャップがあり、ここで一方の側に酢酸イソアミルを導入し、もう一方の側には何も導入しません。これが完了したら、ペトリ皿を閉じて、物質が拡散するまでしばらく待ち、その後、皿を開けます。ここに動物を導入し、一定時間、動物を移動させます。

このアッセイは、ディッシュの一側にtheodorを導入することで、かなり迅速に形成され、かつ試験期間中安定して維持される勾配が生じるという仮定に基づいています。現在の主な課題は、プレート内に勾配が存在することがこれまで誰も証明していない点です。theodorの添加後、極めて短時間でプレート内にtheodorが均一に分布し、勾配が非常に緩やかになっている可能性や、勾配が形成されるまでに数分を要する可能性があります。

これは当然ながら、主に使用されるテオドールの蒸気圧に依存します。2つ目の問題は、実験中に何を定量化するかに関連しています。動物がここ（X）から出発し、3分後にこの端板（赤いX）に到達したと想定してください。ここで、2つのアプローチが考えられます。

一つの方法として、3分または5分といった一定時間が経過した後の動物の最終位置のみを記録することが考えられます。その場合、取得できる情報は開始位置と終了位置のみになりますが、時間の経過に伴う動物の行動について高い解像度で把握することが重要であると考えられます。例えば、ある動物が開始位置から終了位置までほとんど移動しなかった場合もあれば、試行が終了する前に、かなりの時間をかけて周囲の領域を探索し、その後戻ってきた場合もあるからです。

これら2つの状況から導き出される結論は大きく異なります。一方のケースでは動物が刺激に反応しなかった可能性がありますが、もう一方のケースでは確実に反応しています。私たちが達成しようとしている2つの改善点は、まず、アリーナ内のもう一方の勾配の形状と安定性を制御することです。

次に、動物の行動をリアルタイムで追跡し、これらの情報をすべて記録します。次のセクションでは、Sylviaが段階希釈の調製方法を説明します。私はS tiです。

私はVAs研究室のリサーチアシスタントで、材料の準備を担当しています。本日は、動物の追跡に使用するチャンバーシステムの材料準備方法について説明します。私たちのチャンバーシステムにおける主な課題は、空気中に分散させた臭気を使用している点にあります。

これは例えば、使用するアガロースプレートが平坦でない場合、実験間で濃度の変動が生じ、それがシステムにノイズをもたらす可能性があることを意味します。そこで、システム内のノイズを減らすためのちょっとしたコツをいくつかご紹介します。においの希釈液を調製するための材料は、ガラス瓶（光反応性のあるにおいを使用する場合は、できれば遮光瓶）と、目的とするにおいのアリコートです。

この分注液を調製するためのガラスピペットと、適切なメカニカルピペットエイドを用意します。次に、パラフィンオイル用ピペットチップ、標準的なマイクロピペット、および希釈用の小型バイアルを用意してください。バイアルは再度強調しますが、ガラス製で、できれば遮光性のものを使用してください。そして、正確な測定を行い、実験間のノイズを低減させるための電子天秤を用意します。

においは揮発性が高く、中には毒性を持つものもあるため、作業はフード内で行います。においの希釈液を調製する最初のステップは、希釈に使用するにおい物質を分注することです。正確な希釈を行い、実験間のばらつきを最小限に抑えるためには、すべてを秤量する必要があります。

まずラベルを貼り、1 M濃度の酪酸エチルを作成します。最初にパラフィンオイルを準備します。パラフィンオイルは非常に粘度が高いため、気泡が発生しない程度に吸い上げられる最小限の深さまでしかピペットチップを浸さないようにすることが重要です。

その後、ボトルの側面に付着した余分なパラフィンオイルを拭き取ってください。繰り返しになりますが、パラフィンオイルは粘性が高いため、バイアルの中にゆっくりと注入することが非常に重要です。ボトルにパラフィンオイルをピペッティングした後、チップの底にさらにオイルが溜まっているため、すぐにチップを捨てないでください。

希釈を開始する前に、あらかじめ添加するパラフィンオイルの量と重量を算出した計算シートを用意しておくことが推奨されます。同様に、香料についても重量を含めて算出してください。そうすることで、秤を用いて必要な量のパラフィンオイルと香料がすべて揃っているかを確認できます。必要に応じて、正しい重量になるまでパラフィンオイルを追加し、再度測定してください。

適切な親油の重量を量り取ったら、同様の原理を用いて香料を添加します。それでは、ここから幼虫のトラッキング準備の手順を説明します。

通常、孵化後6日目の幼虫を使用します。この日齢の幼虫は、ソフトウェアで容易に検出できる十分な大きさに成長しており、かつ非常に活発であるためです。トラッキングに使用するには幼虫の日齢が進みすぎているかどうかを確認するには、壁を登っている幼虫がいないかを確認してください。壁を登っている個体がいる場合は、日齢が進みすぎており、十分な活性が見られないため使用に適しません。

幼虫を準備する最初のステップは、15% sucroseに浸すことです。15% sucroseを使用する理由は、幼虫がこの溶液中で浮遊し、一方で餌は部分的に溶解するか、あるいは底に沈殿するためです。ボトルまたはバイアルの上端から1インチ弱（約2.5cm）ほどの隙間ができるまで、十分な量のsucroseを注いでください。

次にスパチュラを用意します。幼虫が浮き上がってくるのが見えたら、餌の中に潜り込んでいる個体を追い出すように、餌をそっとかき混ぜます。軽くかき回して幼虫を餌から分離させ、そのまま数分間置きます。餌と幼虫が十分に分離したら、あらかじめラベルを貼ったペトリ皿を用意し、深い部分に注ぎ入れます。

シャーレの蓋は保管しておいてください。後でここに水を満たし、追跡済みの幼虫を入れる容器として使用することで、追跡済みか未追跡かを区別できるようにします。幼虫をシャーレに注いだ後、ショ糖に適応し飢餓状態に達するまで30分間待機させる必要があります。これにより、適応のための30分間の後、追跡セットアップ内での幼虫の挙動が安定します。

スクロース溶液の準備の間は、トラッキング用プレートを準備するのに適したタイミングです。これらは96ウェルプレートの蓋です。別途購入可能です。こちらは、すでに加熱済みの3%アガロース溶液です。

幼虫が潜るのを防ぐために3%を使用していますが、この濃度は幼虫がその上を歩くことができ、かつ各プレートの上面が加湿された状態を維持するのに十分な密度でもあります。アガロースを25 mLピペットで分注します。ゲルの中に大きな気泡ができないようにすることが重要です。

また、プレートを平らな面に置くことも重要です。そうしないと、ゲルに傾斜が生じ、幼虫の行動に影響を与える可能性があります。ゲルが凝固した後、プレートを重ねてサランラップで包み、乾燥を防ぎます。これにより、数日間にわたるトラッキングに適した良好な状態で保持することができます。

このセクションでは、以前にご説明したペトリ皿アッセイとはわずかに異なる、当研究室の行動アッセイについて提示します。準備するものとして、96ウェルプレートの蓋と、アガロ層を含むプレートを用意してください。アッセイは、3枚の蓋を積み重ねて構成されています。

最初の層には何も入っておらず、空の状態であり、システムを下底面から隔離するためだけに使用されます。2番目の層にはDiego agro表面が含まれています。ここに動物を配置し、次に示す通り、プレートにtheodorを導入します。

theodorにサンプルをロードする際は、毎回新しく清潔な蓋を使用することが重要です。これは、実験間でのコンタミネーションを防ぐためです。また、別の希釈液も必要になります。

通常、loading dyeは使用しませんが、ここでは説明のために使用します。こちらは高濃度のloading dyeです。もう一方は非常に希釈されており、直線的にグラジエントを作成することを目的としています。

この手順では、左から右に向かって濃度が高くなるようにします。これを実現するため、濃度を上げた数滴の溶液を凝縮リングの中に配置します。まず、最も高い濃度の溶液から、端に配置して開始します。

リング内に分散させることが重要です。次に、最初の濃度よりも2倍に希釈した次の濃度を用いて、このリングに配置します。これで、6滴の液滴が配置されました。

1本目には、例えば濃度1を調製します。2本目には、その半分の濃度である0.5を調製します。3本目には濃度0.25を調製し、同様に続けます。

このように、直線上に等比級数が形成されます。次のステップでは、この蓋をAAL表面で反転させます。すると、表面張力によって、すべての液滴が蓋の上部に吊り下げられた状態で保持されます。我々は、プレート内のすべての濃度を測定するために、赤外分光法に基づいた手法を考案しました。

この手法を用いることで、ここに示されるように、におい物質のラインに沿って等比級数的に配置すれば、その長さに沿って指数関数的に増加するにおい物質の濃度勾配が得られることを示すことができました。また、プレートの幅方向には、におい物質のラインの直下でピークとなるプロファイルが得られています。こちらが、実際の勾配のジオメトリの外観です。

空気中のtheodorの濃度について検討すると、勾配のジオメトリが少なくとも15分間は安定していることを示すことができた点は好都合です。上蓋を設置した後、勾配が形成されるまで30秒間待ちます。その後、動物をアリーナに導入します。

動物を位置3と4の間の反対側のラインから導入します。小ピンを用いて、幼虫をショ糖溶液からアガロ表面へ移します。幼虫をピンの頭付近にひっかけることで移送を行います。素早く蓋を開け、幼虫をアガロの表面に配置します。

次に、蓋を閉じます。蓋が開いている時間を最小限に抑えることが重要です。続いて、動物の行動を3分間または5分間記録します。

実際の記録を行います。このトラッキング設定では、カメラがコンピュータに接続されています。動物の動きに関する情報を収集し、デジタルファイルとして保存するために、Nordis社のAton visionイメージトラッキングソフトウェアを使用します。

それでは、行動実験を開始します。aro層を塗布した蓋と、希釈液を用意しました。

ディエゴは最初の蓋で手こずっています。theodorをロードする前に、各バイアルをボルテックスすることが重要です。希釈液を使用し、最も低い濃度を左に、最も高い濃度をここに右に配置します。

6つの液滴すべてを同時にプレートに分注します。香りの揮発を防ぐため、ここではマルチチャンネルピペットを使用します。各希釈サンプルから10 µLの香料を採取し、同時に分注します。分注後、蓋をアガロースの表面に逆さまに被せます。

先ほどお見せした通り、プレート上には過去30秒間で勾配が形成されています。ここで、Diego表面に動物を導入します。動物を導入した直後に、記録を開始します。

動物が現れ、現在その動きが追跡されています。見ての通り、動物は誘引物質のラインに沿って、勾配の最高濃度点に向かって進んでいます。濃度は左から右に向かって指数関数的に増加していることに留意してください。

ご覧のように、移動方向は絶えず修正されています。刺激に対して、動物が勾配の最高濃度点に到達したため、プレートから取り出します。同一個体を直接2回追跡しないようにするため、動物は別のプレートに移動させます。

新しい幼虫を導入し、新たに記録を開始した後のトラッキングにおけるルールは以下の通りです。動物がプレートの最高濃度行（こちらの行、およびこちらの行に相当します）に到達した時点で、直ちにトラッキングを停止します。また、干渉を避けるため、動物が壁に接触した場合はトラッキングを中断します。

最初に取り組んだ課題は非常に単純なものでした。私たちが知りたかったのは、動物がある特定の濃度の臭気を感知できるかどうかということです。このような試験を行う際、通常は複数の臭源ではなく、単一の臭源を用います。

これにより、theodorエンドドロップレット内の濃度を変更する際に1つの自由度を持たせることができます。例えば、ここでは高濃度ドロップレットがあり、あちらには低濃度ドロップレットがあります。通常、theodorドロップレットの直下のDiego表面に動物を導入し、動物がその存在を検知して周辺に留まることができるかどうかを確認します。

次に、このアッセイをより高度に活用する方法について説明します。オーダーのある液滴が1つあり、そこに重ね合わせて表示されているように、いくつかの軌跡を記録したと想定してください。ここでは3つの軌跡があります。この緑色のトラックを生成した個体が1つ存在します。

こちらに、中心から外れたオレンジ色の軌跡があり、そして動物が光源の周囲を回っていると思われるピンク色の軌跡があります。軌跡の詳細については、多くの情報が得られると考えています。そのため、これらの軌跡を位置の系列としてMATLABにインポートし、MATLABを用いて解析を行います。

ここでは、おそらく時間の関数としての光源までの距離を示します。以前に表示した3つの軌跡のうち、緑色の軌跡は光源の非常に近くに留まっています。また、オレンジ色の軌跡は、かなり多くのノイズを示しています。

そして、この紫色の軌跡がありますが、興味深いことに、動物が最適な濃度と思われる距離を保つために、光源から離れたことを示しています。ここでは、嗅覚を持たない動物の10本の軌跡のイラストを示します。これらは、嗅覚を失った変異体、すなわち 3B 変異体です。

ご覧の通り、これらの軌跡はすべて、動物が臭源を検知できず、そのまま立ち去ったことを示しています。対照的に、ここでは野生型動物の10回連続の軌跡を記録しました。これらの動物はもちろん嗅覚を有しており、ご覧のように、そのすべてが臭源の直下に集まっています。

先ほど提示した20本のトラジェトリーは、実際には個体の正体を知らされない状態で取得されたものです。これは、本アッセイの効率性と信頼性を実証しています。指数関数的な勾配を用いて、一部のMutantがここで匂いを感知できるか否かを判定するために、我々は複数のトラックを生成し、動物が刺激の反対端をどの程度正確に追跡できるかを確認します。

それでは、個別に記録された15本の軌跡をお見せします。ご覧の通り、動物たちは反対側のラインにある刺激に向かって非常に正確に移動しています。ここで、単純なコントロール実験を行います。指数関数的な勾配において動物たちがラインに沿って移動したのは、濃度に関わらず何らかの刺激が存在したためであり、単に動物たちが直進しただけであるという可能性が十分に考えられるためです。

したがって、それらが実際に濃度、あるいは濃度に関連する何かを計算し、それを運動の方向付けに利用していることを示すために、屋根のような形状のジオメトリを用意しました。通常通り、ここに幼虫を導入します。幼虫が線に沿って移動し、この地点を過ぎて濃度が低下していることを検知して、元の位置に戻ることを期待しています。このテストは5匹の個体を用いて行いました。

軌跡を収集し、このスライド上に重ね合わせて表示しています。ご覧のように、動物はここから出発して線に沿って移動し、その後、最高濃度に相当する領域を探索し、主にそこに留まっています。このことは、単一光源アッセイを用いることで、動物がリアルタイムで濃度勾配を計算できることを強く示唆しています。

私たちは、主に一つの大きな問いを立てることができました。動物は、マルチソースデバイスを用いることで、ある特定の濃度の臭いを検知できるか、ということです。これにより、勾配の形状をより柔軟に変更し、動物がこの情報を利用できるかどうかを判断することが可能になります。

簡単な実験を行って、この考えを説明したいと思います。これまで構築した勾配では、レンズに沿って指数関数的な形状となっていました。そこで、濃度がレンズに沿って線形に増加するように設定して、より困難な条件にした場合でも、それらは反対側の端線までたどり着くことができるのかという点が問題となります。

このグラフは2種類の勾配を表しています。紫色の指数関数的勾配と、緑色の線形勾配をテストしました。これが線形勾配であり、ここにパラフィンオイルで希釈した酢酸イサムの異なる濃度を記入します。

これは等差数列です。線形勾配が形成されますが、ここにある指数関数的勾配と比較すると、傾斜がかなり緩やかであることがわかります。指数関数的勾配では末端の濃度も 0.5 ですが、0.03 まで上昇します。問題は、このような緩やかな勾配に直面したときに、navi が化学走性を呈することができるかどうかです。

ここでは、指数勾配および線形勾配に使用した6つの液滴における酢酸の実際の濃度を示しています。ご覧の通り、線形勾配の場合、どちらのケースでも最高濃度は同じですが、ここでの最低濃度はかなり高くなっています。線形勾配を用いて実験を行った結果、野生型個体の15の軌跡がここに示されており、これらの個体が線形勾配を検知し、デオドラントラインに沿ってこの信号を追跡できたことはかなり明白であると考えられます。

以上のことで、私たちの主旨は明確になったかと思います。ここで締めくくる前に、このトラッキングシステムの今後の方向性について簡単に述べたいと思います。このトラッキングシステムを用いることで、例えば、より広範囲かつ長期間にわたる幼虫の複雑な行動を観察するなど、多くの興味深い研究が可能になりますが、一方でいくつかの制限もあります。

例えば、プレートのサイズに制限があるため、追跡可能な時間や観察できる複雑な行動に制約が生じます。したがって、プレートを大型化するか、あるいはプレートの境界に全く制限されないシステムを開発できれば有用です。もう一つの課題は、現在のソフトウェアでは複数の個体を同時に追跡することが困難であるため、集団行動をリアルタイムで観察することが不可能である点です。

このセットアップでは検証できない行動のもう一つの興味深い側面は、空間における幼虫の実際の三次元的な動きです。動物を追跡していると、例えば、彼らが臭気ドロップレットに到達した際に、頭を上げたり、濃度の変化を検出しようとして頭を左右に振ったりすることが観察されるでしょう。現在の私たちの特定のセットアップではこれが不可能である可能性があるため、これを可能にする手法を開発することが望ましいと考えられます。