眼表面炎症の誘導と関与組織の収集

このプロトコルは、眼の表面炎症の誘発およびマイボーム腺機能障害に関与する関連する罹患臓器の収集に関与するステップを順次説明しています。MGDのこの新しいモデルは、疾患の自然免疫の側面、特にマイボーム腺を閉塞する好中球細胞外トラップの形成の調査を可能にします。プロトコルで示された技術は、前臨床段階で局所治療介入を導入するために拡張することができます。

さらに、眼の滲出液と臓器の収集は、治療の有効性を反映しています。免疫原液の腹腔内注射を行うには、7〜9週齢のC57ブラック6無麻酔雌マウスをケージグリッドをつかみながら尾部でそっと保持する。次に、背中の皮膚と親指と人差し指の間の首の部分をしっかりと保持し、薬指と小指の間の尾と下肢を手のひらに固定します。

マウスを頭を下に向けて固定したまま、調製した免疫原溶液100マイクロリットルを下腹腔の左右象限に注入する。免疫後に眼の表面チャレンジを行うには、麻酔をかけたマウスの眼に5マイクロリットルのオボアルブミンまたは卵子または生理食塩水を塗布し、滴が目に吸収されるまで5分間待ちます。次に、チャレンジ直後に50マイクロリットルの滅菌生理食塩水を眼に塗布して眼の滲出液を収集します。

眼の表面組織を切除するには、マウスを平らな面に置き、70%エタノール綿棒で目の周りの眼窩領域を消毒します。目の周りを切開するには、耳と眼窩後洞の間、および扁平上皮骨の上の表面に沿って垂直に切開を行い、上顎骨に沿って下まぶたの下、前頭骨に沿って上まぶたの上に切開を水平に伸ばします。湾曲した鉗子を使用して、解剖した組織を目の周りで慎重に保持し、組織と眼球を引き出します。

切除した臓器を滅菌PBSに入れます。次に、実体顕微鏡下でメスを使用して、切除した上まぶたの周りの余分な顔面筋組織をトリミングします。結膜を集めるには、上まぶたを乾いたペトリ皿の上に置きます。

次に、細かいピンセットとメスを使用して、まぶたの内面から白っぽい粘液層をそっと剥がします。次に角膜を解剖するために、ドライアイスの上にある新しいドライペトリ皿にアイグローブを置きます。3分後、皿をベンチの表面に安定した位置に置きます。

細かくて鋭いハサミを使用して、辺縁の隣の角膜の境界に小さな切開を行います。眼球の周りのメスで切開を続け、強膜を角膜から分離します。次に、生理食塩水でたっぷりと洗い流して、角膜の裏側から虹彩とレンズの残りを取り除きます。

マイボーム腺とその開口部を評価するには、切除したまぶたを実体顕微鏡下で直立させます。次に、カメラの露光時間とISO設定に従って、白色光落射照明の下で画像をキャプチャします。マイボーム腺領域を評価するには、切除したまぶたを水平位置に置き、赤外線カメラを備えた実体顕微鏡のバックライトをオンにします。

カメラのISOに合わせて露出時間を調整して画像を撮影します。生理食塩水を投与されたマウスは、目を大きく開いた状態で健康な眼の表面を示した。それに比べて、卵子の塗布は、重度の眼表面の炎症、目の狭い開口部、およびケモシスの兆候を誘発します。

切除されたまぶたは、まぶたの内側を覆う腺の小さなプラグを示す健康なまぶたとは対照的に、マイボーム腺の開口部を塞ぐ大きな閉塞と浮腫を示しました。腺の赤外線透過照明をさらに調べると、マイボーム腺の腺房のラセミ体の外観が明らかになります。生理食塩水チャレンジマウスのまぶたは丸い腺房を示した。

比較すると、卵子の塗布は、アレルギー性眼疾患またはAEDでいくつかの腺の破壊と喪失を誘発しました。まぶたの組織学的分析では、生理食塩水のみを投与したマウスと比較して、マイボーム腺が拡張した。ドライアイス上で眼球をインキュベートすると、辺縁の隣の角膜を切開し、角膜を強膜から分離することができました。

この研究は角膜の収集を容易にした。さらに、卵子投与は充血の外観で結膜に重度の炎症を与えました。ケモカインCXCL-1のレベルの上昇は、好中球の血管外漏出、食作用、および脱顆粒を促進し、急性期応答および好中球浸潤を媒介するインターロイキン-6がAEDマウスの上清で観察されました。

一方、インターロイキン-10の濃度は、ナイーブマウスとAEDマウスの両方で有意な変化を示さなかった。この新しいモデルは、自然免疫経路を標的とする薬剤の開発と有効性の評価を可能にし、抗炎症剤の投与方法に関するデータマイニングに大いに役立ちます。臓器を適切に採取した後、シングルセルシーケンシングやイメージングマスサイトメトリーなどの高度にマルチプレックスな方法は、このプロトコルと互換性があります。