マルチオームシーケンシングのための新鮮および凍結固形腫瘍標本からの最適化された核分離(英語)
2023年10月13日
このプロトコルは、10x Genomicsプラットフォームを使用したマルチオームシーケンシングのための固形腫瘍標本からの核の分離に信頼性が高く最適化されたアプローチを提供し、組織解離条件、単一細胞懸濁液の凍結保存、および単離された核の評価に関する推奨事項を含みます。
腫瘍生物学に関する知識が深まり、細胞が腫瘍内でどのように相互作用し、患者の転帰に影響を与えるかの複雑さを理解することへの関心が高まるにつれて、腫瘍微小環境全体で不均一な細胞を分析することの重要性も高まっています。マルチオームシーケンシングは、シングルセルRNAの取得と、同じ細胞からのアタックシーケンシングをペアセル方式で可能にし、この目的に向けて大きな進歩をもたらします。しかし、これらの実験から得られるデータの質は、実験条件や投入された生体物質の質に大きく依存します。
このプロトコルは、10x Genomicsプラットフォームを使用したマルチオームシーケンシングのために、固形腫瘍標本から核を分離するための信頼性が高く最適化されたアプローチを提供します。このプロトコルは、新鮮または凍結したシングルセル懸濁液を使用して信頼性があります。組織解離条件、単一細胞懸濁液の凍結保存、および単離核の評価に関する推奨事項を提供します。
このプロトコルでは、私たちの研究室で焦点を当てている一次組織タイプのヒト膵管腺癌標本を使用しました。膵臓がんは、高度に線維形成性の高い腫瘍タイプであり、細胞だけでなく組織も比較的粘着性があります。また、研究に利用できる膵臓腫瘍の標本も比較的少ない傾向にあるため、捕捉する細胞の量を最大化する努力が払われています。
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概要
本プロトコルでは、10x Genomicsプラットフォームを用いたマルチオームシーケンシングのために、固形腫瘍検体から核を単離するための信頼性が高く最適化された手法について概説します。これには、組織解離条件および単一細胞懸濁液の凍結保存に関する推奨事項が含まれています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 腫瘍学
- ゲノミクス
背景
- 腫瘍生物学を理解することは、患者の転帰を改善するために極めて重要です。
- 腫瘍微小環境における不均一な細胞の解析は、重要性がますます高まっています。
- マルチオームシーケンシングにより、シングルセルRNAシーケンシングとATACシーケンシングのペアでの取得が可能になります。
- データの品質は、実験条件および生物学的材料に大きく依存します。
研究目的
- 固形腫瘍から核を単離するための信頼性の高いプロトコルを提供すること。
- マルチオミクスシーケンシングデータの品質を向上させること。
- 腫瘍微小環境の解析を促進すること。
使用方法
- 固形腫瘍検体からの核の単離。
- 新鮮または凍結単一細胞懸濁液の使用。
- 組織解離条件に関する推奨事項。
- 単一細胞懸濁液の凍結保存法。
主な結果
- 核分離のための最適化されたアプローチを確立した。
- 新鮮および凍結サンプルの両方から信頼性の高い結果を得た。
- マルチオミクスシーケンシングのデータ品質を向上させた。
- 組織処理および凍結保存のためのガイドラインを提供した。
結論
- 本プロトコルは、腫瘍からの核分離の信頼性を向上させます。
- マルチオームシーケンシング技術の発展を支援します。
- 今後の研究は、改善された実験条件から利益を得ることができます。
よくある質問
業界における重要性
固形腫瘍検体からの最適化された核分画の単離は、高品質なマルチオームシーケンシングデータを生成するために極めて重要であり、トランスレーショナルオンコロジーにおける腫瘍の不均一性解析の信頼性に直接影響を与えます。本プロトコルでは、新鮮および凍結された線維化を伴う腫瘍組織の両方から、無傷の核を抽出するという課題に対処し、堅牢なシングルセルマルチオミックプロファイリングを支援します。この段階で信頼性の高い核調製を行うことにより、下流の探索およびバイオマーカー開発パイプラインにおける予測の信頼性が向上します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲット検証
- 単一細胞レベルでの腫瘍細胞の不均一性に関する高精度な解析を可能にします。
- 細胞分離時に多様な細胞集団を保持することで、機能的なターゲット検証をサポートします。
- 腫瘍微小環境を正確に再現することにより、メカニズム的なリスク低減を促進します。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 再現性のあるマルチオームシーケンシングアッセイのため、標準化された核調製を提供します。
- ダウンストリームワークフローにおける入力材料の定量的および定性的な一貫性を確保します。
- 新鮮および凍結保存された腫瘍サンプルの両方に対応することで、アッセイの準備効率を向上させます。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- RNAとクロマチンのアクセシビリティプロファイリングのペア解析を可能にすることで、トランスレーショナルバイオマーカーの探索と整合させます。
- 固形腫瘍の微小環境の複雑性を捉えることで、疾患との関連性を維持します。
- 入力サンプルの品質を標準化することで、探索から前臨床検証までの継続性をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この核分離プロトコルは、組織処理とマルチオミクスデータの生成の接点に位置し、初期の発見的研究とトランスレーショナルリサーチのワークフローを橋渡しするものです。
- 探索生物学：細胞の多様性と完全性を維持することで、仮説検証能力を最大化します。
- スクリーニング：スケーラブルなマルチオームシーケンシングアッセイに不可欠な、再現性の高い高品質な核を提供します。
- 分析：腫瘍細胞の状態およびクロマチン景観を比較するための、堅牢な定量的リードアウトを可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：単一細胞RNA-seqおよびATAC-seqのペア解析をサポートし、バイオマーカーの整合性を促進します。
- エンタープライズでの再利用：多様な固形腫瘍の種類やサンプル条件に適応可能な、標準化されたプロトコルを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：腫瘍生物学およびターゲット検証研究における予測の信頼性を向上させます。
- 運用的価値：新鮮および凍結腫瘍サンプルにおける再現性と拡張性を高めます。
- 戦略的価値：サンプル調製段階におけるデータ損失やアーティファクト導入のリスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響：リスクを調整したオンコロジー創薬およびトランスレーショナルプログラムの推進を支援します。
実施上の考慮事項
- 最適な回収量と品質を得るためには、組織解離および核の取り扱いに関する専門知識が必要です。
- 特殊な試薬、セルストレーナー、および定量的評価ツールの利用が不可欠です。
- 再現性を確保するためには、消化および溶解条件についてチーム間での標準化が必要です。
- 腫瘍の種類やサンプルサイズに応じて、特に結締組織増殖性組織については条件を最適化する必要があります。
- 下流のシーケンシングにおけるアーティファクトを避けるため、核の完全性を慎重にモニタリングすることが不可欠です。
