単層グラフェンのクライオ電子顕微鏡グリッドへの高分解能構造決定への応用
2023年11月10日
極低温電子顕微鏡(クライオEM)グリッドに支持層を適用することで、粒子密度を高め、空気と水の界面との相互作用を制限し、ビーム誘起運動を低減し、粒子配向の分布を改善することができます。この論文では、クライオサンプル調製を改善するために、クライオ電子顕微鏡グリッドをグラフェンの単層でコーティングするための堅牢なプロトコルについて説明します。
クライオ電子顕微鏡サンプル調製における一般的な課題は、粒子が気水界面に局在し、粒子が好ましい配向と変性を引き起こすことです。それよりも、グラフェンが促進するように、薄膜が支える格子表面に粒子を静止させる方が良い。もう一つの課題は、比較的高いサンプル濃度を必要とすることですが、これもグラフェンで対処できます。
グラフェンコーティングされたグリッドは、クライオ電子顕微鏡の構造決定に多くの利点をもたらしますが、歴史的に、社内で再現性を持って製造することは困難であり、商業的に購入するには法外なコストがかかりました。このプロトコルにより、単層グラフェンの堅牢な堆積が可能になり、これらのグリッドを研究に採用するユーザーの障壁が低くなります。グラフェンは、その材料特性において独特です。
炭素の単層であるため、バックグラウンドノイズが最小限に抑えられます。アモルファスカーボンや酸化グラフェンフレークの薄層など、他のクライオ電子顕微鏡グリッド担体は、単一の単層として適用することはできず、より多くのバックグラウンドシグナルに寄与します。グラフェンをクライオ電子顕微鏡グリッドに応用するための堅牢なプロトコルを確立したので、細胞溶解物から直接オングリッドを捕捉するためのアフィニティーハンドルを備えたグラフェン被覆グリッドの機能化を追求したいと考えています。
これにより、クライオ電子顕微鏡試料作製における別のボトルネックが軽減される可能性があります。
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概要
本記事では、クライオ電子顕微鏡（cryoEM）グリッドにグラフェンの単分子層をコーティングするプロトコルを紹介します。グラフェンを使用することで、粒子の密度を高め、気液界面との相互作用を最小限に抑え、粒子の配向分布を改善することができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- クライオ電子顕微鏡法
- 材料科学
- 試料調製技術
背景
- 気液界面における粒子の局在化は、クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）における共通の課題です。
- 優先的な配向性は、粒子の変性を引き起こす可能性があります。
- グラフェンサポートは、粒子をグリッド表面に保持させるのに有用です。
- 従来、グラフェンコーティングされたグリッドの作製は困難であり、コストもかかっていました。
研究目的
- クライオ電子顕微鏡（cryoEM）グリッドへの単層グラフェンの堆積に関する堅牢なプロトコルを提供すること。
- 研究者がグラフェンコーティンググリッドを利用するための障壁を低くすること。
- クライオ電子顕微鏡による構造決定の利点を高めること。
使用した手法
- グラフェンコーティングのためのプロトコルの開発。
- 粒子密度および配向性の評価。
- グラフェンコーティング済みグリッドと従来のグリッドとの比較。
- グリッド作製における再現性の評価。
主な結果
- グラフェンコーティンググリッドにより、粒子の局在化が大幅に改善されます。
- 粒子密度の向上により、より精度の高い構造決定が可能になります。
- 堅牢なプロトコルにより、施設内でのグラフェングリッド作製が容易になります。
- コストが削減され、研究者の利用しやすさが向上します。
結論
- クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）グリッドへのグラフェンの導入は、試料調製における主要な課題を解決します。
- 本プロトコルにより、研究におけるグラフェンコーティンググリッドのより幅広い活用が可能になります。
- グラフェンの特有の性質により、cryo-EMの機能が向上します。
よくある質問
業界における実用的意義
クライオ電子顕微鏡（cryoEM）における試料調製のボトルネックは、初期の創薬探索や構造生物学のパイプラインにおける高解像度構造決定のスループットと信頼性を制限しています。クライオEMグリッドに単層グラフェンを適用することで、粒子の局在化、配向バイアス、および試料濃度の要求量という極めて重要な課題が解決され、ターゲットバリデーションやメカニズム研究における予測の確信度に直接的な影響を与えます。堅牢で再現性のあるグラフェングリッドプロトコルの確立は、企業によるより広範な導入を可能にし、リスク調整後のポートフォリオの推進と効率的なリソース配分を支援します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的活用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 高分子標的の構造解析を、原子に近い分解能で高精度に行うことが可能です。
- サンプルの変性と配向バイアスを低減し、メカニズム解析におけるリスク軽減を支援します。
- 粒子密度とイメージングの整合性を向上させることで、確実な標的バリデーションを促進します。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- ダウンストリームのcryoEMワークフローに向けて、標準化され再現性のあるグリッドサポートを調製します。
- バックグラウンドノイズを最小限に抑え、定量的イメージング出力を向上させることで、アッセイの信頼性を高めます。
- より低濃度の試料において、構造的に多様な複合体のスケーラブルなスクリーニングをサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患に関連する複合体の構造研究を可能にし、トランスレーショナルなバイオマーカーの整合性をサポートします。
- 創薬段階の構造解析から、分子メカニズムの前臨床検証までの継続性を提供します。
- 構造データの品質を確保することで、開発後半段階における生物学的失敗のリスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
単層グラフェングリッドの調製は、初期の発見からリード化合物の同定、さらには前臨床研究に至るまでのcryoEMワークフローに組み込まれており、仮説に基づいた構造決定やメカニズムの解明を支援します。
- 探索生物学： 条件間での正確な構造比較を可能にし、堅牢な帰無仮説検定をサポートします。
- スクリーニング： 定量イメージングおよびアッセイの標準化に向けた、再現性の高い低バックグラウンドのグリッドを提供します。
- 分析： 統計分析および意思決定に不可欠な、高品質の回折パターンと密度マップを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： 疾患関連の標的および複合体に関する構造データの連続性を維持します。
- 企業的な再利用： 多様な研究開発プログラムに対応する、スケーラブルで再現可能なグリッド作成能力を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 構造研究における予測の信頼性を向上させ、メカニズムの曖昧さを軽減します。
- 運用的価値： グリッド調製を標準化し、再現性を高め、サンプル投入量を削減します。
- 戦略的価値： サンプル調製のボトルネックを解消することで、go/no-go判断の質と資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： 構造的に検証されたターゲットのリスク調整済み優先順位付けと推進を可能にします。
実施上の検討事項
- グラフェンの取り扱いおよびcryoEMグリッド作製の専門知識が必要です。
- スピンコーター、グロー放電装置、およびUVオゾンクリーナーへのアクセスが必要です。
- 再現性とデータの比較可能性を確保するため、チーム間での標準化が求められます。
- 異なる高分子系やサンプルタイプに合わせて最適化が必要な場合があります。
- 実用上の制限として、脆弱なサンプルの取り扱いや、転写時の単分子層の完全性の確保が挙げられます。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:35
Preparing MMA‐Coated CVD Graphene for Fabrication of Graphene‐Coated CryoEM Grids
3:27
Preparing Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares for Attaching to CryoEM Grids
5:14
Fabricating Graphene‐Coated Cryo‐EM Grids Using Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares
