ライブFRET顕微鏡法および免疫蛍光法による初期ゼブラフィッシュヌーナン症候群モデルにおけるERK活性調節を評価するための効率的なプロトコール

複雑な発生疾患のゼブラフィッシュモデルを作成し、患者の配列決定と機能ゲノミクスを結びつけて変異解釈や前臨床薬物試験を支援しています。FRETセンサーの改良にもかかわらず、十分な空間感度を持つRas-MAPKシグナル伝達の微細な病原性変化を検出する堅牢なin vivoアッセイは依然として不足しています。まず、E3培地に成形された2%アガロースを含むカスタムマイクロインジェクションプレートを作業プラットフォームに置きます。

受精したティーンゼブラフィッシュの卵をプレート内で適切なレーンに配置し、マイクロインジェクション中の卵の動きを制限します。マイクロローダーピペットを使って、注射材料2マイクロリットルをバックローディングします。マイクロインジェクション装置の針と胚の品質に基づいて、圧力と時間設定を調整して各注射を校正します。

この溶液をティーンゼブラフィッシュ胚の1細胞段階に注入します。管理された飼育条件下でマイクロインジェンダーされた10代胚を育てます。沈着後3時間以内に濁っていたり変性した卵を除去してください。

受精後約4時間後、標準的な蛍光立体顕微鏡を用いて、波長範囲を465ナノメートルから500ナノメートルに設定します。胚の蛍光報告者の発現をスクリーニングします。FRET画像診断のためにティーンポジティブな魚を選び、陰性の兄弟姉妹は免疫組織化学的評価のために予約します。

6ウェルプレートの異なるウェルに、同数の胚プールを配置します。治療を開始するには、胚をDMSOまたは希釈したMEKを含むE3培地に所望濃度で3ミリリットル浸します。まず、1.5%から2%の低融点アガロースアリコートを50度摂氏のサーモミサーで溶かします。

溶かしたら温度を約30度まで下げます。35ミリガラスの底皿の中央に1つの注入されたティーン陽性胚を位置付け、ライブ画像撮影を行います。余分なE3培地を取り除き、低融点のアガロースを1滴加えて胚を固定します。

アガロースを室温で重合させます。獲得の少なくとも1時間前にインキュベーターコントローラーをオンにし、胚の健康を維持するために温度を28度に設定してください。インキュベーターが安定したら、胚を入れたイメージングディッシュをサンプルホルダーに置き、10倍のドライ対物レンズでサンプルを観察します。

アルゴンイオンレーザーを起動し、レーザー出力を50%に調整します。ハードウェア設定で画像を取得するには8ビット深度解像度を選択してください。次に、取得パネルでスペクトル検出モードのxy、gamma、lambda、zスキャンモードを選択し、フォーマット画像を512×512ピクセル、スキャン速度400ヘルツ、光学ズーム0.75に設定します。アルゴンイオンレーザーの458ナノメートルレーザーラインを起動し、その強度値を8.5%に設定します。次にハイブリッド検出器を選択し、感度を500に設定します。

検出器バーのドロップダウンメニューを開き、シアン蛍光タンパク質またはECFP放出曲線を選択します。YPETの発光曲線を表示するには、2つ目の検出器を作動させます。次に黄色蛍光タンパク質のYFP放出曲線を選択します。

ライブ取得を開始するには、検出カーソルを最も強いYFP信号の範囲に配置し、サンプルを可視化します。Z-Stack LASXウィンドウで試料厚さの開始位置と終了位置を設定します。ガンマスキャン範囲の特性を検出範囲の460ナノメートルから570ナノメートルまで設定します。

検出帯域幅を5ナノメートル、スキャンステップサイズを5ナノメートルと定義します。Zスタックの取得を開始しましょう。スペクトルの漏れを排除するために、構成ウィンドウ内の染料データベースにCFPおよびYFP用の適応された2つの参照放射スペクトルを挿入・保存します。

イメージングセッションから得られたスペクトル画像ファイルを選択し、プロセスウィンドウを開きます。次に、染料分離ツールで「スペクトル染料分離」を選択し、染料分離の設定を調整します。ダイアログの左側にあるドロップダウンリストで、最初の位置に新しいCFP放射スペクトルを選択し、スペクトルデータベースから新しいYFP放射スペクトルを選択してください。

画像のガンマスキャンでは、信号強度が最も強い画像を特定します。次にZスキャンに沿って進み、マージンゾーンの関心のある領域をハイライトする光学セクションを選択します。動物極のマージンゾーンでROI選択モードを有効にし、最適なスペクトルを持つ領域を定義します。

表示ウィンドウのROIクロスヘアをクリックし、測定エリアで参照ROIのサイズを40ボクセルに調整してください。分離された2つのチャンネルを含む新しく生成されたファイルを開きます。最大強度投影を用いて三次元画像系列から二次元投影画像を作成します。

プロセスウィンドウで、チャンネルを2つの別々のファイル、チャンネル1とチャンネル2に分けるためにトリミングを選択します。プロセスウィンドウで「画像結合」を選択し、チャンネル2のファイルを選択して最初のオプションに挿入します。次にチャンネル1のファイルを選択して、2つ目のオプションに挿入します。

係数5でリスケールを設定し、比率操作を選択します。「適用」をクリックすると、比率メトリック画像を含む新しいファイルを生成できます。データ分析用にファイルを保存してください。

スペクトルイメージングおよび染料分離画像ファイルをオープンソースのFijiソフトウェアにインポートして分析してください。フィジーでの読み取り測定のパラメータを「Analyze and Set Measurements」で設定してください。関心のあるパラメータとして面積、積分密度、平均グレー値を選択します。

ツールバーのポリゴン選択ツールを使って、ガストルラのマージンに対応する関心領域を選択します。順に「分析」「ツール」「ROIマネージャー」をクリックしてROI xy仕様を保存してください。選択したROIで測定を行うには、「分析と測定」をクリックしてください。

各ROIのFRET比率値をワークシートに整理し、実験グループを列に、生の値を行に配置します。単一の生物学的複製の場合、1つのグループ化変数を持つ列テーブルを作成し、各グループは列で定義されます。原腸形成の終わりに、胚をPBSで調製した4%パラルデヒドに浸して室温で20分間固定します。

固定後は胚をPBSで数回洗浄します。パスターピペットを用いて、新鮮なPBSを含む12ウェルプレートの1つのウェル内で胚を横方向に配置します。2.7倍倍の対物レンズ、0.63倍走査対物レンズ、8.6ズームのステレオ顕微鏡を用いて、明視野モードで画像をキャプチャして楕円形の存在を評価します。

捕獲した胚画像をフィジーのソフトウェアにインポートしてください。胚の軸の長さを測定するには、ツールバーから直線ツールを選択し、「分析」をクリックし、「測定」をクリックしてください。選択した測定値を行った後、ROIマネージャーリストに追加し、ROIファイルを保存します。

データをワークシートにエクスポートします。長軸の長さを短軸の長さで割って軸の比率を計算します。平均、平均の標準偏差、または異なる複製の平均の標準誤差を計算します。

ゼブラフィッシュにおける当社のライブFRETパイプラインは、病原性ERKシグナル活性化の早期で感度の高い検出を可能にし、変異解釈の支援およびMEK阻害剤効率試験を支援しています。