極低温同時蛍光、電子、イオンビーム顕微鏡を用いた細胞のターゲットミリングのためのワークフロー

私の研究は、集束イオンビームミリング中に極低温ラメラの細胞特徴を保存する光学顕微鏡法を開発し、低温電子断層撮影による詳細な解析を通じて、固有の生物学的組織を明らかにすることを可能にします。光学顕微鏡はCryoFIB-SEMシステムに統合されていますが、FIBと同じ位置で行われることは稀です。これにより、最終ラメラに蛍光標識された標的を保存するために登録ベースの指導手法が必要です。

まず、ステージが極低温に達したら液体窒素を使って手動でトランスファーステーションを冷却します。クリップされたオートグリッドを、極低温光学顕微鏡システム用に設計されたサンプルカセットに積み込みます。オートグリッドが接着されたカバースリップとスペーサーの間に位置していることを確認してください。

リングスクリューを締めてカセットを閉じ、トランスファーステーションのスロットに差し込みます。転送ステーションを極温光学顕微鏡システムに接続してください。内部チャンバーカメラを使ってサンプルカセットをサンプルステージに誘導します。

光学顕微鏡ソフトウェアでは、試料ステージをロード位置からあらかじめ定義された3ビーム位置に移動させます。FIB-SEMソフトウェアで倍率を100Xに設定し、左上のウィンドウをクリックします。光学顕微鏡ソフトのアライメントタブでZをクリックし、Play機能を選択してグリッドのSEMアトラスを取得します。

壊れた炭素膜のある四角い部分を特定し、それをダブルクリックしてサンプルステージをその場所に移動させます。ソフトウェアインターフェースに戻る。FIBを起動して画像を取得。

左上のドロップダウンメニューで倍率を調整してください。再生ボタンを押してFIB画像を表示します。次にスライドバーでステップサイズを設定します。

次にZとZをクリックして、イオン内の水平線と電子像が同じ特徴に合うまでステージZの位置を調整します。光顕微鏡ソフトのSEMタブを選択します。またはXボタンとYボタンを使って、SEM画像とイオン画像の共通特徴を合わせます。

今度は蛍光顕微鏡をつけて。FLMタブを選択し、反射光イメージング条件を設定し、再生を選択します。次に反射光の画像をSEM画像と照合します。

画像をズームして、長方形オプションをクリックしてイオンビームのミリングパターンを定義します。ディスプレイ2の「スタートパターニング」を押して、集束イオンビームを使って小さなパターンをミル加工します。ミル加工されたパターンが集束イオンビームと蛍光顕微鏡の両方で見えるか確認してください。

光学顕微鏡ソフトで「局所化」タブに移動し、適切な条件を有効にして蛍光チャンネルを設定してください。各蛍光分子を別々のチャンネルに割り当て、明視野用の追加チャンネルを追加してください。各蛍光チャンネルのLED出力と露光時間を調整し、ターゲットを特定します。

パラメータが満足したら、軸方向をステップしてプレミリング蛍光Zスタックを取得します。次にターゲットを関心地域としてマークします。FIB-SEMソフトウェアに切り替え、関心のある領域にラメラを描きます。

蛍光顕微鏡をつけて信号変化を監視しつつ、粗加工でバルク材を除去します。端末からPythonベースの干渉計ツールキットを開き、ラメラ薄化中の蛍光信号を監視します。清掃断面積モードを用いてROIを約2マイクロメートルに薄めます。

軸方向範囲が300ナノメートルを超えるターゲットの場合、PythonのGUIで蛍光顕微鏡写真でターゲットを選択します。ソフトウェアは新しいフレームごとに時間の関数として明るさのプロットを自動的に始めます。Pythonツールキットを使って蛍光強度を監視してください。

サンプルを洗浄断面モードでミルし、対象領域の下の残存支持膜を除去します。蛍光強度の急激な低下を観察し、それがミリング方向の切り替えの手がかりとなります。下から上へフライング時に急激な減少が見られた場合は、停止して上からからフライスを始めてください。

トップダウンミリングを終えた後、下から上にクリーニング断面モードでミスを行い、希望の厚さに達するまでラメラを仕上げます。その後、ラメラのミリング後の蛍光画像を撮影します。サンプルをCryoTEMに移します。

ミリング後のマルチチャネル蛍光画像とCryoTEM投影画像をカスタム射影変換ソフトウェアに読み込み、関心領域の登録を行います。次に、蛍光顕微鏡と電子顕微鏡の両方で見える8対から10組の基準点を選び、射影変換を計算します。重ねた画像をガイドとして使い、撮影エリアを選択します。

その後、ターゲット構造の大きさや望む解像度に応じて、傾き系列に適した倍率と取得パラメータを選択します。SiR-チューブリンで標識された分化したマクロファージ細胞は、MTOCに対応する直径約1マイクロメートルの単一の明るい蛍光点を示し、さらに微小管ネットワークに一致する線維筋膜状構造が細胞周辺に放射されていました。試料が約800ナノメートルの厚さにミル加工されると、単一の蛍光MTOCプンクタムは直径約700ナノメートルの2つの異なる斑点に分解されました。

非蛍光のバルク材料と吸収支持膜を除去した後、蛍光強度は増加し、その後ラメラが2マイクロメートルから200ナノメートル以下にさらに薄くなるにつれて急激に減少しました。相関した低温蛍光と電子顕微鏡により、ミリング中の構造の正確なターゲット特定が可能となりました。再構築されたトモグラムおよび節節モデルにより、中心細胞は微小管三つ組から構成されていることが明らかになりました。

最終ラメラに1つの蛍光斑点のみが残る場合、対応するトモグラムで1つの中心細胞が確認されました。ミリミリングに基づく蛍光の精度は、回折制限による解像度、屈折率の不一致、さらにミリングによる運動の影響を大きく受けるレジストレーション手法によって制限されます。同時光学顕微鏡とFIBミリングは、蛍光顕微鏡からのリアルタイムフィードバックを用いてミリングプロセスを導くことで、登録エラーを除去します。

これにより回折限界や屈折率の不一致による誤差を避け、最終ラメラ内で蛍光標識構造を保存し、クライオ電子断層撮影のために精密なミリングが可能になります。私たちの研究により、これまでクライオETで直接可視化が困難だった細胞構造を観察できるようになり、幅広い微小分子機械の背後にある分子メカニズムを明らかにしました。