成体Xenopusにおけるアクセシブルな組織を包括的にサンプリングするための効率的な技術

この研究は、アフリカツメガエルの心室、動脈幹、左肝葉、胆嚢、肺、膵臓、脾臓、喉頭、食道、胃、腸、精巣、脂肪体、卵管、対腎臓、坐骨神経叢、皮膚、胸腺、および目全体を1時間以内に迅速に収集するための複製可能な方法を作成することを目的としています。実験上の課題は、組織の鮮度を最適化することです。このため、プロトコルは 1 時間以内に完了するように設計されています。組織の鮮度を優先することで、これらの組織を使用して、使用する動物の数を最小限に抑えながら、プロテオミクスなどの高品質の生化学分析を完了できます。将来的には、脳、筋肉、骨など、アクセスがより困難な組織に関するプロトコルを作成する予定です。

[講師]まず、解剖手順のために安楽死させたカエルを配置し、手足を固定します。解剖はさみを使用して、正中線に沿って皮膚を切断し、次に横方向に切断して2つの皮膚皮弁を作成します。鉗子を使用して、白線をつかみ、体腔から引き離します。筋肉組織を頭に向かって慎重に切り取り、空洞壁の2つのフラップを作成します。ウラコイド骨を減らして、心臓へのアクセスを改善します。心膜を伸ばし、穴を開け、剥がして3つの心室を露出させます。次に、心室と動脈幹と出会う接合部でオラクルをトリミングします。鉗子を使用して心室の頂点をつかみ、動脈幹との接合部のすぐ下でマージンを残して切断します。動脈幹の分岐点を観察し、体幹をぴんと張って引っ張り、アーチに分裂した点の直後に大動脈幹を切断します。次に、左肝葉の唇をつかみ、そっと持ち上げて肝管と胆嚢管を露出させます。これらのアタッチメントの下にある左葉の下部の3分の2をサンプリングします。胆嚢を特定した後、胆嚢をつかんで右肝葉から引き離し、その付着を切断します。次に、肺の頂点をつかみ、ぴんと張って引っ張ります。肺が気管支に移行する境界で肺を切断します。喉頭から気管支を取り除きます。卵巣を摘出するには、卵巣葉をそれぞれの側に移動して、腎臓の腹側の付着部位を視覚化します。はさみを使用して、損傷を与えることなく腎臓に近い卵巣を取り除きます。次に、正中葉としても知られる肝臓の前葉を検査し、中膜を通る十二指腸との接続を観察します。虹彩切除はさみを使用して、中膜靭帯と肝十二指腸靭帯を切断します。残りの肉質の塊は膵臓と総胆管です。膵臓と総胆管の接続を前肝葉から切断し、マージンを残します。歯付き鉗子で胃をつかみ、組織鉗子で膵臓の一端をつかみます。拡大して、膵臓を胃からそっとからかいます。次に、脾臓を特定し、腹膜への付着物を切断してサンプリングします。喉頭の下端をつかみ、喉頭を空洞から持ち上げ始め、腹膜付着物に遭遇したら切断します。喉頭が隆起したら、湾曲した虹彩切除はさみを使用して、食道組織を喉頭から慎重に分離して切断します。次に、喉頭を下に引っ張り、口腔から切り取り、残っている目に見える付着物を切断します。食道と腸の始まりを示す幽門制限と区別する胃の湾曲を観察します。胃の湾曲のすぐ前方で消化管を切断し、食道から分離します。口を開けて、その屋根にある耳管の共有開口部を見つけます。口を開けたまま食道を引っ張って付着を観察する。次に、耳管開口部のすぐ下の頬腔から食道を切り取ります。次に食道を取り除きます。次に、胃をつかみ、十二指腸に接続する幽門制限でそれを切断します。結腸をピンと張って、総排出腔にできるだけ近づけて切ります。腸を取り除き、途中で目に見える腹膜付着物を切断します。カエルがオスの場合は、精巣を特定し、虹彩切除はさみを使用して精巣を除去し、腎臓が無傷のままであることを確認します。太った体をからかい、それぞれの側に配置して、腎臓近くの腹膜付着物を露出させます。太った体の付け根をつかみ、腹膜から切り取り、余白を残します。膀胱を取り除くには、総排出腔のできるだけ近くで切断します。カエルがメスであるか、痕跡卵管が目に見える場合は、卵管の下端をつかみ、総排出腔から引き離します。総排出腔の近くの卵管を切断し、体腔から引き抜き、腹膜付着物を切断します。 鉗子を使用して、後腹膜の対になった腎臓をつかみ、その基部で腹膜を切断します。腎臓を空洞から持ち上げ、すべての腹膜付着物を切断します。次に、鉗子で坐骨神経叢の神経束をつかみ、体腔から出る神経を切断します。神経束を持ち上げ、脊柱との接続部で再度切断します。次に、ピンを取り外し、動物を腹側にひっくり返します。手足をピンで固定し、サンプリングする後肢の1つを選択し、足をピンで留めます。腓腹筋と脛骨腓骨領域の上の皮膚のアーモンド型の部分を切除します。背側の皮膚をつかみ、動物の中央部の周りを横方向に切開します。連続した円形カットを作成します。ピンを外し、片手で脚を固定し、ラットの歯付き鉗子を使用して前背側皮膚をつかみます。背側の皮膚を頭と腕の上に強制的に引っ張って、動物の皮を剥ぎます。胸腺をサンプリングするには、顎関節を覆う脂肪塊を特定し、ピンク色の筋肉組織と融合する塊の後縁を切断します。虹彩切除はさみを使用して、骨から塊を切り取り、メラノフォアクラスターが存在する場合は、露出させます。次に、組織を切り取り、筋肉や軟骨を除去します。次に、動物を再ピンし、目を選択します。湾曲した虹彩切除はさみを眼窩に挿入し、目の湾曲の周りをそっと切り取り、筋肉の付着物を解放します。最後に、はさみを眼窩の奥深くにスライドさせ、目の後ろの視神経を切断します。目を眼窩から外し、残っている筋肉を切り取ります。この手順に従うことにより、安楽死後1時間以内にすべての主要臓器が抽出され、すすぎ、トリミングされました。