ローズベンガルを用いた光線力学療法の in vitro 応用のための革新的LED照明装置の開発

私たちの研究の範囲は、効果的な治療選択肢のないがんの治療における光線力学療法の効果を特徴付けることを目的とした基礎的およびトランスレーショナル プロジェクトを開発することです。現在の実験課題は、新しい光増感剤や新しい照明装置など、光線力学療法の実施に必要な技術を、in vitroから臨床応用まで開発することです。他の技術と比較して、私たちのプロトコルには低コストの自家製デバイスが含まれており、96ウェルプレートと細胞培養インキュベーター内の生理学的状態をより寛大に照射することができます。

まず、培養したHepG2細胞をインキュベーターから取り出し、フラスコを事前に洗浄された微生物安全ステーションの下に置きます。ピペットを使用して、培地を培養フラスコから取り出します。残留培地を除去するには、穏やかに混合しながらリン酸緩衝液ですすぎ、緩衝液を慎重に取り除きます。

次に、0.25%トリプシンと0.53ミリモルEDTAを含む3ミリリットルのトリプシン溶液を細胞に適用し、培養物を摂氏37度のインキュベーターに5分間戻して細胞を分離します。5分後、フラスコに7ミリリットルの培地を加えてトリプシンを中和し、細胞を懸濁します。次に、トリプシン、培地、および分離した細胞を15ミリリットルの遠心分離管に移します。

細胞を数えるには、20マイクロリットルの細胞溶液をきれいなチューブにピペットで入れ、20マイクロリットルのトリパンブルー溶液を加えます。混合後、染色した混合物を計数スライドにロードし、セルカウンターに挿入します。次に、培地をチューブに加え、細胞を導入して最終濃度150, 000細胞/ミリリットルに達する。

ウェルあたり1.5倍10の4細胞の乗を、底が透明で平らな白い96ウェルプレートに播種します。生存率読み取り時間ごとに2枚のプレートを準備します。処理前にプレートを24時間インキュベートして、細胞を付着させます。

ローズベンガルの原液を調製するには、10%生理食塩水に溶かします。ローズベンガル処理液を細胞培養培地中で0〜100マイクロモルの範囲の濃度で希釈します。次に、細胞プレートから培地を取り出し、調製したローズベンガル処理液100マイクロリットルを各ウェルに加えます。

細胞をローズベンガルと2時間インキュベートして、内在化を可能にします。2時間後、各ウェルからローズベンガル溶液を取り出し、細胞をPBSで2回洗浄し、PBSを吸引し、ウェルあたり100マイクロリットルのローズベンガルフリー培地を加えます。マイクロプレートをアルミホイルで覆って光から保護し、光線力学療法アッセイ中の照明のためにプレートの半分を取っておきます。

配光板のオスコネクタを光源のメスコネクタに接続します。光線力学療法と暗条件のマイクロプレートをインキュベーターから取り出します。光線力学療法プレートを開封します。

次に、LED ドライバーの調光器を最大レベルに設定して、96 個のウェル全体で 0.62 ミリワット/平方センチメートルの平均放射照度を提供します。その後、プレートを配光装置に置きます。細胞に所望の光量が達成されるまでマイクロプレートを照らします。

希望の光量に達したら、デバイスの電源を切ります。光線力学療法マイクロプレートをアルミホイルで再包み、生存率試験が実行されるまで、コントロールプレートと一緒にインキュベーターに戻します。光線力学療法アッセイが完了したら、照射されたプレートをインキュベーターに24時間入れて、治療後の細胞反応を可能にします。

インキュベーション期間が経過した後、1枚の照明付きプレートと1枚の非照明プレートを取り出します。細胞生存率アッセイキットから100マイクロリットルの試薬を各ウェルに加え、ミトコンドリア代謝とATP産生を測定します。発光測定に進む前に、プレートを暗所で10分間インキュベートします。

10分後、マルチモーダルリーダーを使用して各ウェルの発光を読み取ります。未処理のコントロールウェルからの発光は、100%の生存率を表すと考えてください。処理されたウェルの発光値をこのコントロールに正規化して、各処理条件の生存率を計算します。

24時間、48時間、72時間などの追加の処理後の時点で、細胞生存率測定について同じプロトコルを繰り返します。ローズベンガルを含まない照明のみでは、テストされた光線量のいずれでもHepG2細胞の生存率は変化せず、光を使わないローズベンガルのみも、すべての濃度で有意な変化を引き起こさなかった。CELL-LED-550/3 を使用したローズ ベンガル媒介光線力学療法は、すべての光線量で HepG2 細胞の生存率を大幅に低下させ、強力な細胞毒性効果を示しました。

LED発光プロファイルとローズベンガルの吸収スペクトルとの重複により、CELL-LED-550/3デバイスと光増感剤のスペクトル適合性が確認されました。将来的には、特定のがん細胞の標的化を可能にする感光性化合物と関連する照明デバイスの両方を含む新しいPDTパッケージを開発することが重要です。