LEXYおよびLINuSオプトジェネティクスツールと自動画像解析を使用して、生細胞の核細胞質輸送ダイナミクスを定量化します

私たちの研究室では、核孔とクロマチン組織の相互作用を研究しています。そこで私たちは、核孔がクロマチン組織にどのように影響するかを研究しますが、クロマチン組織が核孔機能、特に核細胞質輸送に影響を与えるかどうかも研究します。核細胞質輸送は非常に高速なプロセスであるため、生細胞における核細胞質輸送のダイナミクスの変化を検出することが課題の1つです。

生細胞内の核細胞質輸送を監視するために利用できるツールは多くありません。半自動化および改良された技術を実装することで、これらのツールの使用を容易にしたいと考えています。私たちのプロトコルはディープラーニングに基づいています。

誤差を制限し、解析に必要な時間を大幅に短縮します。以前は1日かかっていたことが、今では1時間か2時間しかかかりません。まず、コンピュータシステムでFIJIソフトウェアを起動します。

安定相を画像1として、照明相を画像2として、回復相を画像3として選択します。3つのフェーズを表す3つの画像を連結して、1つの画像を作成します。取得したマージされた画像をセグメンテーション用に保存するには、[ファイル] に移動し、[TIFF として保存] を選択します。

次に、[画像]、[色]、および[チャネルの分割]を選択して、mCherryチャネルを分割します。次に、[ファイル]、[名前を付けて保存]、および [TIFF] に移動して分割画像を保存します。取得中に漂白を確認するには、画像、スタック、およびプロットZ軸プロファイルを順番に選択します。

次に、[データ]をクリックし、続いて[最初のデータセットをコピー]をクリックし、Z軸プロファイルセルの下にあるスプレッドシートに貼り付けます。次に、[分析]、[ツール]、[ROI マネージャー] の順にクリックして、原子核の平均サイズを近似する円形の関心領域を描画します。ROI を追加し、[その他] に移動し、[保存] をクリックして保存します。

タイムラプス中は、保存したROIをセルのない領域に配置します。[測定値の解析と設定]で[平均グレー値]が選択されていることを確認してください。次に、[その他]、[マルチメジャー]の順にクリックします。

「50 スライスすべてを測定」と「スライスごとに 1 つの ROI」にチェックを入れ、「OK」をクリックして強度を記録します。測定されたすべての強度値をコピーして、ROIの背景セルの下にあるスプレッドシートに貼り付けます。次に、mCherry チャネルのみで画像を閉じ、マージされたチャネルで保存された画像を選択します。

次に、Plugins、Tracking、TrackMateを順番にクリックして、TrackMateプラグインを開きます。時点の範囲が 0 から 49 であることを確認し、[次へ] をクリックします。StarDist検出器を選択し、[Next]をクリックします。

核セグメンテーションにチャネル2、SiR-DNAを選択し、プロセスが完了するまで待ちます。しきい値ウィンドウにデフォルトのパラメーターを残して、[次へ]をクリックします。平均強度、チャネル 1 を使用してフィルターを作成し、極端な信号値を持つ原子核を除外します。

1 つのフィルターを作成して、定義されたしきい値を超える値を選択し、もう 1 つのフィルターを作成して、しきい値を下回る値を選択します。同様に、2 つのエリア フィルターを追加して、破片や死にかけている細胞を削除し、[次へ] をクリックします。シンプルLAPトラッカーを選択し、[次へ]をクリックします。

次に、トラッキングパラメータを調整します。[リンク最大距離]を 30 マイクロメートル、[ギャップ閉鎖最大距離] を 15 マイクロメートル、[ギャップ閉鎖最大フレーム ギャップ] を 3 に設定します。次に、[次へ] をクリックします。

計算が終わったら、次へをクリックしてトラックにフィルターを設定します。全時間コースで追跡された核のみを選択するには、トラック内の最大数のスポットを選択して[次へ]をクリックします。次に、スポット名の表示」にチェックを入れて、さらなる分析で各核をトレースし、必要に応じて他の表示機能をカスタマイズします。

ページ下部の「トラック」をクリックし、「CSVにエクスポート」を選択して測定表を保存します。テーブルを閉じて、[次へ] をクリックして続行します。次に、アクションとして「オーバーレイのキャプチャ」をクリックし、[実行]を押してから[OK]を押して、追跡された核を含む画像を生成します。

[ファイル]、[名前を付けて保存]を順番にクリックし、[TIFF]を選択して画像を保存します。TrackMate CSV ファイルを提供されたスプレッドシートにインポートするには、[データ] タブをクリックします。[変換データの取得]グループで、[テキスト/ CSVから]をクリックし、[インポート]をクリックします。

列スポットIDB、トラックIDC、フレームI、および平均強度チャネル1Mをコピーし、提供されたスプレッドシートの列AからDに貼り付けます。結果をアルファベット順に、最初にセル B5 のトラック ID、個々の核、次にセル C5 のフレーム、時点で並べ替えます。次に、GraphPad Prismを開き、新しいシートを作成し、スプレッドシートから時間列をコピーして貼り付けます。次に、相対核強度として取得した値をGraphPadプリズムテーブルに貼り付けます。

相対核強度グラフを生成するには、[グラフ]セクションに移動し、グラフファミリーとして[XY]を選択します。次に、グラフの種類として「ポイントとエラーバーのある接続線」を選択します。プロット設定で、平均値と誤差、SEMを選択し、OKをクリックします。次に、エクスポートレートを取得するには、[新しいデータテーブル]をクリックし、安定フェーズと照明フェーズのみの時間を小数点で入力します。

これらの相の相対核強度として得られた値を表に貼り付けます。[結果]セクションで、[XY分析]をクリックし、続いて[指数関数]をクリックします。次に、[非線形回帰] を選択し、[OK] をクリックします。パラメータの下のモデルとして、Plateau then then one phase decay」を選択します。

次に、プラトーの定数を X0 として 2.25 に等しく、1 に等しい定数を Y0 として、およびプラトーの定数を 0 として選択します。K が 0 より大きくなければならないことを示し、OK を押します。新しいテーブルを作成し、取得した K 値を貼り付けて転置します。[グラフ] セクションで、グラフ ファミリとして [列] を選択し、グラフ タイプとしてバイオリン プロットを選択します。

プロットとして「すべての点を表示」を選択し、「OK」をクリックします。光遺伝学的プローブlexyによる核輸出は、生細胞イメージングで視覚化されました。メタノール処理細胞を用いた対照条件では、青色光照射後に核mCherry強度が急激に低下し、その後、照射後の段階で徐々に回復しました。輸出阻害剤であるレプトマイシンBによる治療は、プローブ信号がすべての時点で一貫して核のままだったため、核輸出に変化を引き起こしました。

相対核強度の定量分析により、照明段階の終わりにプラトーに達するまで、時間の経過とともにゆっくりと減少することが示されました。中間のレプトマイシンB濃度は、穏やかな核輸出を示すはずです。強度データから計算された輸出率は、メタノール処理細胞で有意に高い輸出率、0.5ナノモルのレプトマイシンBでははるかに低い率、および1ナノモルのレプトマイシンBでの輸出がほとんどないことを確認しました。