急性呼吸困難症候群に備えたアンカー依存性間質細胞のマイクロバイオリアクター生成

細胞が環境とどのように相互作用するか、治療薬として細胞の製造や製造の過程も研究します。ここでは、MSCや間葉質質、幹細胞などのアンカーレッジ依存性細胞がどのように作製され、臨床翻訳の障壁を克服できるかという疑問に取り組んでいます。細胞集団の変動が、各バッチや各個人の最終細胞製品の一貫性と有効性の両方に影響を与えるという認識が高まっています。

これらの課題は、一部の細胞療法の規制承認にも影響を及ぼすことがあります。環境を高度にコントロールし、スケールアップ可能な方法で、1ミリリットルあたりの液体あたり多くの細胞数を達成できるギャップを目指しています。このプロトコルは、MSCのようにアンカージュ依存の細胞に対してインライン環境モニタリングを含める方法を提供します。

このプロセス制御は、今でも多くの実験室や臨床生産で使われているフラスコに比べて大きな利点です。MSCや機械的な手がかりに敏感な他の細胞タイプについては、いくつかの未解決の課題があります。例えば、このようなアプローチが他の疾患状態に対応するための細胞工学にどのように役立つのでしょうか?

まず、ボトルラックのボトルLLに繋がっている透明なプラスチックキャップを外してください。プランジャーなしの新しい滅菌50ミリリットルシリンジを使い、ノズルをボトルLLに接続します。滅菌されたろ過水をシリンジのバレルに注ぎ、ボトルLLに注入します。同様に、ボトルLにはFBSなしの低グルコースDMEM25ミリリットル、ボトルRには滅菌PBS25ミリリットル、ボトルRRには8ミリリットルの付着防止洗浄液を注ぎます。実験に必要な消耗品の数を準備するために同じ手順を繰り返します。

次に、実験で使用する各ポッドに対して自己テストを行います。ポッドが自己検査のすべてのチェックに合格したら、自己検査カセットを取り出して光保護された収納袋に入れます。消耗品をバイオリアクターに取り付けろ。

消耗バルブの緑色のテープを外し、消耗品をポッドに取り付けてください。クランプを再取り付けて、シューッという音がないか確認してしっかり密閉しているか確認してください。消耗品とベースステーションまたはポッドの間に、白い圧力センサーライン、赤い空気圧ライン、青い真空ラインを接続します。

新しい実験を開始する前に、側面注入ポートが白い涙滴型クランプでしっかりと閉まっているか確認してください。ソフトウェアインターフェースの「Flush Bottles」アイコンをクリックしてください。ボトルLのラジオボタンを有効にし、「Output to Waste」を選択し、「MSCセラムのフラッシュ開始」をクリックします。

ボトル内容ウィンドウで、MSCserumがPBSを含むRボトルに位置していることを示します。次に手動操作に切り替え、廃棄物ボトルに3回の排出洗浄サイクルを実行します。ボトルの内容ウィンドウでは、MSCserumが現在、付着防止洗浄液を含むボトルRRに設置されていることを示しています。

手動操作に戻り、廃棄物ボトルに1回のイジェクトウォッシュサイクルを行ってください。30分後にPBSで消耗品を洗い流します。リアクターを空にしてセルとマイクロキャリアの注入を待つ。

手動作戦パネルで「再接種」をクリックします。ダッシュボードが反応器への接種プロンプトを表示する段階でシステムを一時停止させておく。次に、計算された再懸濁細胞の体積を、各状態に対応したマイクロキャリアを含む15ミリリットルの円錐形チューブにピペット移します。

各チューブに新鮮で温かいヒト間葉幹細胞培地を2.2ミリリットルから2.5ミリリットルまで補充します。一度に1つか2つの消耗品を扱い、ベースステーションから取り外してバイオセーフティキャビネットに入れます。細胞とマイクロキャリアの混合物を緑色の4インチ鈍針で5ミリリットルの注射器に抽出します。

混合物を原子炉に注入します。カセットの底部近くのインジェクションポートラインを、外さないように注意しながら掴みます。親指と人差し指の間で転がす動きを使い、注入ポートラインを2回転させてラインに結び目のある曲がりを作ります。

結び目を注射ポートの根元の切り抜きスペースに差し込み、小さな実験用テープで固定します。その後、消耗品を基地局に戻します。すべての消耗品に注射を繰り返した後、ソフトウェアインターフェースを操作して接種完了を示します。

ソフトウェアがホームページに戻ったら、消耗品の出力ラインから白いクランプを外してください。手動操作に入り、排出ポートをPに設定してエジェクトエクスド機能を実行します。静的ミキシングモードを有効にし、1回のサイクルで680秒オン、120秒オフし、ミキシング周波数を5ヘルツに設定します。

細胞採取を始めるには、1ミリリットルの注射器を使って200マイクロリットルのプロナーゼと約300〜400マイクロリットルの空気を抽出します。サイドポートのインジェクションラインのキャップを外し、ニードルレスバルブコネクターに70%エタノールをスプレーします。結び目のあるサイドポートの注入ラインからテープを外し、結び目をほどき、白い涙滴型クランプを外します。

次に、1ミリリットルの注射器を接続し、プロナーゼを優しく原子炉に注入します。液体を完全に届けるために空気で追いかけます。ティアドロップクランプを再度巻き込み、注入ラインのキャップを再度取り付けてください。

その後、消耗品をポッドに戻し、すべてのラインを再接続し、白いCクランプを外してミキシングを再開します。廃棄物ボトルとメディアソースボトルを氷の上に置きます。5分タイマーをセットして、プロナーゼが原子炉内のマイクロキャリアを消化するのを待ってください。

5分後に、原子炉内でマイクロキャリアの有無を確認して劣化を確認します。Manual Opsを入力してセルを収穫し、サイクル数を3に設定し、廃棄用にOutput Port Wを選択し、「Eject Wash」をクリックします。エジェクトウォッシュサイクルが終了した後、消耗品をバイオセーフティキャビネットに移します。

その後、10ミリットルまたは20ミリリットルの注射器で廃棄物ボトルの中身を抽出します。廃棄ボトルの中身を15ミリリットルの円錐形遠心分離機管に注ぎます。細胞を300gで5分間遠心分離します。

上澄液を吸引し、細胞ペレットの大きさを評価してください。pH、温度、溶存酸素、二酸化炭素などの環境条件は、微生物反応器システム内の10日間の培養期間を通じて安定的に維持されました。マイクロバイオリアクターのpH変動は、組織培養ポリスチレンフラスコの状態と比べて有意に低かった。

マイクロバイオリアクターの細胞収率はT25フラスコよりも高く、細胞の生存率はほぼ同じでした。測定された14のポテンシー関連の重要品質特性のうち、9つはT75フラスコと比較してマイクロバイオリアクター条件下で有意に高いmRNA発現を示しました。