蛍光脂肪酸類似体を用いた内皮脂肪酸取り込みの定量化

脂肪酸のような血液媒介栄養素は、代謝組織に入るためには、まだ十分に理解されていないメカニズムを通じて毛細血管内皮関門を通過しなければなりません。これらのプロセスを明確にすることで、2型糖尿病などの代謝疾患治療のための新たな治療標的が明らかになる可能性があります。その結果、メス筋と脂肪組織は、内皮脂質の取り込みと輸送を、部分的に内分泌系によって制御されるパラクリン代謝物を使って調節していることがわかりました。

また、ミトコンドリアATPは解糖系ATPに依存していることが知られているにもかかわらず、予想外に内皮脂肪の取り込みに寄与していることもわかっています。本プロトコルで示されたアッセイを用いて、内皮脂肪酸の取り込みと輸送の分子メカニズム、さらに他の組織によってどのように調節されるかをさらに深く探る予定です。まず、2%ゼラチンストック25ミリリットルをPBS475ミリリットルに加え、0.1%ゼラチン溶液を準備します。

ゼラチン溶液を十分に混ぜ、0.2マイクロメートルの真空フィルターまたはオートクレーブでろ過・滅菌します。ピペットを使って、黒い透明底面の96ウェルプレートの各ウェルに0.1%ゼラチン溶液100マイクロリットルを加えます。プレートを37度のインキュベーターに少なくとも30分または一晩置いてください。

培養後、あらかじめコーティングされた96ウェルプレートから余分なゼラチン溶液を取り除きます。皿をPBSで一度洗ってください。その後、各ウェルに細胞懸濁液100マイクロリットルをピペットで送り込み、翌日までに細胞同士が合流に達するようシーディング密度を調整します。

陽性対照として、3-ヒドロキシイソ酪酸と乳酸を20ミリモラー溶液で準備します。陰性コントロールには、微小摩ル1つのニクロスアミドを使います。その後、溶液を別の96ウェルプレートにピペットで移します。

内皮細胞を事前に温めた二価PBSで一度洗浄し、プレート化された細胞を乱さないように急な角度でピペットします。適切な処理試薬を1ウェルあたり50マイクロリットル追加し、37度で30分または60分培養します。BODIPY脂肪酸BSA複合体を調製するには、2マイクロモルのBODIPY脂肪酸溶液と1マイクロモルの無脂肪酸BSAをPBSで混合します。

使用前に室温の暗い場所で10分間孵育してください。次に、処理した各製品に50マイクロリットルのBODIPY脂肪酸BSA複合体を加え、37度で5分間培養します。PBSに脂肪酸を含まないBSAを1マイクロモル溶液で洗浄バッファーとして準備し、37度まで予温します。

BODIPY脂肪酸BSA複合体をウェルから取り出し、50マイクロリットルの予備温めた洗浄バッファーでプレート全体を2回洗浄し、各洗浄ごとに1.5分間行います。次に、各ウェルに0.08%のトリパンブルーを50マイクロリットル加えて細胞外蛍光を消火します。マイクロプレートリーダーを用いて、すぐに細胞内の蛍光を測定します。

トリパンブルー溶液をウェルから取り出した後、細胞をPBSで優しく洗浄します。各ウェルに10%培地で希釈したホエスト染料1ミリリットルあたり4マイクログラムを加えます。プレートを37度で30分間孵化させます。

その後、プレートをPBSで一度洗って余分な染料を落とします。その後、各ウェルに新鮮なPBSを追加し、マイクロプレートリーダーでホーヒスト蛍光を測定します。HUVECおよびEA.hy926細胞の両方において、培養1分、5分、10分のBODIPY-C12シグナルはBODIPY-C12脂肪酸濃度が高いほど有意に増加しました。

乳酸1時間治療により、5ミリモラーおよび20ミリモラー濃度で用量依存的にBODIPY-C12の取り込みが増加しました。3-ヒドロキシイソ酪酸の処理も用量依存的にBODIPY-C12の取り込みを有意に増加させ、最も高い取り込み量は20ミリモルで観察されました。1マイクロモラルニクロサミドを30分間投与したところ、未処理のDMSO対照群と比較してBODIPY-C12の取り込みが有意に減少しました。

HUVEC中のBODIPY-C16による5分間の潜伏後、10ミリモラーおよび20ミリモラーでの乳酸処理が用量依存的に有意に増加しました。1マイクロモルニクロサミドの処理は、未治療のDMSO対照群と比較してBODIPY-C16の取り込みを有意に減少させました。