MALDIアプローチ による 細菌プロテオミクスプロファイリングを用いた酪農の微生物安全性の評価

私たちは、牛乳、クリーム、バター、チーズなど、さまざまな日用品から微生物群集を準備・分離するためのプロトコルを開発しました。一度分離されると、この微生物はMALDI-TOFマイクロスを用いて迅速かつ正確に同定できます。培養条件の最適化は依然として重要な課題であり、データベースのギャップやグラム陽性菌や胞子形成菌の抽出が困難であることも課題です。まずは、乳製品の代表的なサンプルを入手し、均一性を確保するために十分に混ぜます。

無菌状態で、固体サンプル1ミリリットルまたは1グラムを、9ミリリットルの無菌液体培地を含む15ミリリットルの円錐遠心分離機チューブに移します。試料を均質化するために、30秒から60秒間激しくチューブをボルテックスします。次に、均質化された懸濁液を1ミリリットルの連続したチューブに移し、それぞれ9ミリリットルの滅菌溶液を含んで10倍の希釈を準備します。

各希釈物をボルテックスやシェイクでよく混ぜます。次に、元のサンプルまたは調製した希釈液のいずれかを0.1ミリリットル取り、適切な寒天培地を含む準備済みのペトリ皿の表面に移します。滅菌スプレッダーを使い、接種物を寒天プレートの表面に均等に散布します。

好気培養のために、準備済みサンプルとともにAPT、M17、CBL、MPCA、TSA寒天プレートに接種してください。プレートは好気条件、摂氏37度、30度で24時間培養します。嫌気培養の場合は、接種済みMRS寒天プレートを嫌気性チャンバーに入れ、37度および30度で24〜72時間培養します。

培養皿をインキュベーターから取り出し、毎日検査して微生物の成長を監視してください。1マイクロリットルの微生物ループを使い、選ばれたコロニーを同じ寒天培地にストリークしてサブカルチャーします。以前と同じ条件下で孵化してください。

質量分析では、まずMALDIマトリックス溶液を準備します。溶媒混合物は50%アセトニトリル、47.5%HPLCグレードの水、2.5%トリクロロ酢酸で準備します。マトリックス化合物を溶媒混合物に溶け込み、最終濃度は約10ミリグラム/ミリリットルにします。

直接コロニー移転法を用いたMS細菌の同定には、滅菌ループを使って培養した細菌コロニーの1マイクロリットルをMALDIターゲットプレート上のスポットに移します。細菌の物質を広げて、プレートに薄く均一な層を作ります。乾燥したら、上にHCCAマトリックス溶液を1マイクロリットル加え、室温で自然乾燥させます。

ターゲット通りの蟻酸抽出法では、使い捨ての微生物ループや滅菌の爪楊枝を使って、単一のコロニーから少量の細菌バイオマスを採取します。材料をMALDIターゲットプレートのスポットに直接塗り、薄く均一な層を作ります。塗りついた部分に70%の蟻酸溶液を1マイクロリットル加えます。

斑点が乾いたら、1マイクロリットルのHCCAマトリックス溶液を重ねて室温で自然乾燥させます。チューブ内タンパク質抽出法では、寒天培養プレートから1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に1〜3つの完全なコロニーを移し、300マイクロリットルの滅菌水を含みます。最終的なエタノール濃度は約75%に達するため、絶対エタノールを900マイクロリットル加えます。内容物を短時間混合した後、室温で15,000gの真空管を2分間遠心分離します。

その後、細胞ペレットを乱さずに上清液を慎重に捨てます。次に、乾燥細胞ペレットに70%の蟻酸を20〜50マイクロリットル加えます。ピペッティングやボルテックスで内容物を混ぜ、ペレットが完全に再懸浮するまで続けます。

次に、蟻酸懸濁液に同量のアセトニトリルを加え、十分に混ぜます。チューブを15,000gで2分間遠心分離します。得られた上澄液を1マイクロリットルのMALDIターゲットプレートの指定箇所に移し、乾燥させます。

次に、乾燥した部分に1マイクロリットルのHCCAマトリックス溶液を重ねます。大腸菌DH5α抽出物を含む細菌試験標準液または、大腸菌ATCC 25922タンパク質抽出物、リボヌクレアーゼ、ミオグロビンを含む微生物学校正器のいずれかを1マイクロリットルピペットで抽出します。スペクトル取得および微生物同定のために、MALDIターゲットプレート上の校正スポットを準備します。

MALDIターゲットプレートに準備済みの試料スポットとキャリブラントスポットの両方を質量分析装置に搭載します。校正解析を校正モードで実行し、システムの校正を行います。一般スペクトル取得のために、質量分析計を線形正イオンモードで操作してください。

次に、質量分析計の質量検出範囲を2,000から20,000の質量対電荷比に設定します。各スポットごとにスペクトルを二重に取得し、サンプルごとに少なくとも4つの技術的複製を生成します。次に、Savitzky-Golay法を平滑化アルゴリズムとして適用します。

TopHatアルゴリズムを使ってベースライン補正を行い、バックグラウンドノイズを除去します。次に、重心モードでピークを検出します。未知の細菌分離株の処理済み質量スペクトルをMALDIソフトウェア内の微生物同定プラットフォームにアップロードし、同定を実行します。

メーカーの閾値基準に従って識別スコアを評価してください。質量分析スペクトルは種特異的なタンパク質プロファイルを示し、属や種レベルでの同定を可能にしました。樹状組図は、同種の系統間で高い類似性が観察され、種間で明確な区別が見られた。

Bacillus licheniformisは12時間の短い潜伏期間で2.38の高いIDスコア値となり、18〜24時間の長い潜伏期間では胞子信号の優性によりIDスコア値が1.85と低くなりました。サンプル調製法の中で、チューブ内タンパク質抽出が最も高いIDスコア2.23、次いでオンターゲットの蟻酸抽出が1.97、直接コロニートランスファーが最も低いスコア1.61でした。カルチュロミクスと合わせたサンプル調製を組み合わせることで、MALDIはより精密かつ高速なマイクロバイオーム解析を低コストで可能にし、参照される16S rRNA法と同等の結果を得られます。

このプロトコルにより、乳製品中の微生物のルーチンかつ高スループットのモニタリングが可能となり、検出速度と精度が向上し、最終的には食品の品質と安全システムを強化します。MALDIデータベースの拡充と産業ラボのワークフロー自動化は、微生物同定の向上、スループットの向上、エラーの削減、そして微生物群モニタリングの迅速化につながります。