個々のsEVの表面強化ラマン散乱に基づくバイオセンシングの疾患診断および治療への応用を探る

私たちは表面強化ラマン散乱と機械学習を組み合わせて、がんの早期診断に取り組み、また生物医学的応用も提供しています。重要な実験課題は、エクソソーム試料の本質的な異質性、非常に複雑で高次元の分光データ、そして低い信号対雑音比によってさらに複雑化していることです。まず、約5マイクロリットルの小さな細胞外小胞サンプルを指定されたプラズモニック基質にピペットします。

基質を乾燥機に入れて、約15分間完全に乾かします。その後、乾燥した基質を共焦点ラマン顕微鏡に移します。計測用ソフトウェアWiREバージョン4.4を使用して、データ収集を開始します。

励起レーザーを785ナノメートル、5ミリワットに設定し、システムを校正します。金基板からスペクトルを取得するには、300×300マイクロメートルの範囲で静的モードで10マイクロメートルステップサイズ、0.1秒露光、50%レーザー出力で単一の小胞を特定するための偵察スキャンを行います。小胞が特定されたら、1マイクロメートルのステップサイズ、0.2秒の露光、50%レーザー出力を用いて、5×5グリッド内で静止モードで高解像度マッピングを行います。

次に、以下のスキャンを行いグラフェン基板からスペクトルを取得します。初期の生スペクトルをスクリーニングし、過剰なノイズや異常なスペクトル形状を示すものは除外します。各スペクトルにサヴィツク・ゴレイフィルターを適用し、蛍光背景を低減しスペクトルデータを平滑化します。

各スペクトルの信号対雑音比をピーク対ベースライン法または標準偏差法のいずれかで計算します。各スペクトルについて、信号対雑音比を、代表的なラマンバンドでの基準線減算後のピーク強度とノイズの標準偏差の比率として計算します。元のスペクトルからウィンドウサイズ11、多項式次数3を用いて、Savitsky-Golay平滑化されたスペクトル版を差し引いてノイズを推定します。

すべてのスペクトルを信号対雑音比の昇順にランク付けし、ランク付けされたスペクトル全体で診断ピークの持続性を評価して閾値を決定します。次に、これらのピークのいずれかが基準ノイズに消える点でしきい値を設定し、信号対雑音比28に対応します。信号対雑音比の閾値28を下回るスペクトルは除外し、高品質なスペクトルのみを後続解析のために保持します。

そして、残った各スペクトルを最大ピーク強度または曲線下の総面積に正規化します。各スペクトル測定値に、例えば胃がん患者や健康な対照群など、その出所に基づいてラベルを割り当てます。ラベル付きスペクトルデータを線形核を持つサポートベクトル分類器に入力し、5重クロス検証のために層別シャッフル分割を適用して各折りのバランスの取れた表現を確保します。

次に、すべてのフォールドで精度指標を平均してモデル全体のパフォーマンスを評価します。最後に、線形判別解析(LDA)を用いて、表面強化ラマン散乱データセットの次元を低減し、可視化します。訓練済み線形判別解析モデルを用いて、サンプルグループ間の直接分類を行います。

対応する平均スペクトルを用いたラマンスペクトルは、組織、血液、唾液サンプルから単離された単一の小さな細胞外小胞から取得された各サンプルタイプ間で異なる分子シグネチャーを示しました。線形識別解析により、細胞外小胞データの発生源組織、血液、唾液ごとに明確にクラスタリングされていることが明らかになりました。サポートベクター機械分類器を用いた二値分類では、組織サンプルで90.1%の最高精度を達成し、次いで血液が70.9%、唾液が60.7%となります。LDAに基づく分類は、組織由来の細胞外小胞データにおいて健康ながんと胃がんのサンプルを明確に分離します。

血液および唾液由来の細胞外小胞データの類似のLDAに基づく分類分割では、健康サンプルとがんサンプル間の最適な分離がより劣ることが示されました。グラフェンなしのドキソルビシン培養胞のラマンスペクトルは、約1,081、1、206、1,440センチメートルの一貫したピークを示しました。グラフェンの場合、約1,350反センチメートルのDピークと約1,580逆センチメートルのGピークが内部標準として観測されました。

ドキソルビシンピークの442度の逆センチメートルのグラフェンGピークの比率は、薬物濃度が高く、潜伏時間が長くなるほど増加しました。早期診断の可能性を示す疾患源を識別するために、単一の小胞生化学的指紋識別を確立しました。私たちの技術の3つの大きな利点があります。

一つ目は、非常に敏感なことです。二つ目は、非侵襲的であること。三つ目は、粒子を分解する、つまり物理的に分解する必要がないことです。

将来的には、スペクトルプロファイルとプロテオームプロファイルを相関させ、これによりエクソーム含有量と細胞通信や輸送などの特定の機能との相関を助ける予定です。