脳転移のモデル化:立体定位皮質内注射による転移性コロナゼーションおよび組織学的成長パターンの標準化解析

私たちのグループは、腫瘍細胞がどのように脳に定着し、転移性成長パターンが臨床転帰や治療反応にどのように影響するかを調査しています。まずは、精密スケールでマウスの体重を測り、体重に基づいて必要な麻酔薬の量を計算します。麻酔薬を投与した後、マウスを温めた温熱パッドの上に置き、温度調節を助けるために37〜38度に保温し、角膜の乾燥を防ぐために眼軟膏を塗ります。

地元の動物倫理委員会が承認した無菌技術でマウスを準備してください。ヨウ素系溶液で頭皮を徹底的に消毒してください。麻酔の深さを足の指をつまんで確認し、皮膚を張ってから滅菌メスで頭蓋骨の中央に約3〜4ミリの切開を入れます。

同じメスで骨膜を優しく削り取り、頭蓋骨の表面を露出させます。耳バーを使ってネズミの頭部を立体視固定します。定位腕を使い、ブレグマを見つけ、腕を前方2ミリ、右側に1ミリ外側に動かし、前頭皮質の標的部位に外科的マーカーを付けます。

マークされた部位で精密な歯科用ドリルで頭蓋骨を慎重にドリルし、硬膜が貫通しないように注意してください。無菌鉗子で優しく部位を探って開口を確認します。次に、ピペットで上下に分散させて腫瘍細胞の懸浮液を再懸垂させます。

サスペンション3マイクロリットルを10マイクロリットルのハミルトンシリンジに詰め、適切なホルダーを使って立体定位フレームに挿入します。注射の一貫性を確保するために、ベベルが左側を向くように、注射針をバーホールの上に慎重に配置してください。針を脳組織に縦に3.5ミリメートルの深さまで挿入します。

必要な深さに達したら、細胞懸浮液の逆流を防ぐために針を0.5ミリゆっくり引き抜き、腫瘍細胞の懸濁液を1分間ゆっくりと3マイクロリットル注射します。注射後は、細胞と細胞外マトリックスが落ち着き、逆流を最小限に抑えるために、さらに2分間針をそのままにしてください。その後、慎重に注射器を引き抜き、マウスを立体視フレームから外します。

頭蓋骨を無菌の0.9%塩化ナトリウム溶液で優しくすすいでい、骨蝋でバーホールを塞ぎます。頭皮の切開部を3〜4本の縫合糸で閉じ、各縫合糸を傷口の縁に3本のきつく結びつけて最適な治癒を促します。指定された識別番号に対応した適切な耳パンチパターンでネズミの耳をマークします。

必要に応じて眼軟膏を再塗り、回復中の角膜乾燥を防ぎ、37〜38度の温めた温めパッドに戻して麻酔回復を助けます。ハミルトン注射器は、針と樽を蒸留水で、次に70%エタノール、最後に滅菌の0.9%塩化ナトリウム溶液で3回連続して洗い流し、徹底的に洗浄・消毒します。すすいで後、ハミルトンシリンジは氷で保管し、次の使用まで待ちます。

最後に、マウスが麻酔下にある間に皮下で鎮痛剤を投与し、術後の即時の痛みの緩和を確実にします。回復中は1時間以内の個別の環境で飼育し、目が覚めている動物と回復中の動物の相互作用による怪我を防ぐために短時間だけ飼育します。モニタリング期間中に苦痛や異常行動の兆候が見られた場合は、握力や協調性を評価するためにハンギングワイヤーテストを用いて神経機能を評価します。

マウスを水平ワイヤーに吊るし、60秒以内に脱出プラットフォームに到達したかどうかを記録します。健康でないマウスがプラットフォームに届かず、ワイヤーから落ちてしまいます。安楽死後、動物組織を採取し、転移の組織学的成長パターンとデジタル組織スライド上の関連特徴を評価します。

巨視鏡画像により、ECM注入コントロールバルブCマウスでは腫瘍増殖が認められず、腫瘍細胞ECM懸濁液を注入したマウスでは目に見える転移病変が認められました。4T1または410.4の乳がん細胞を注入したマウスは、ECM注射対照群と比較して有意に高い転移性負担を示し、両腫瘍細胞株間に有意な差はありませんでした。Kaplan Meyerの生存分析では、410.4個の腫瘍細胞を注入したマウスは、4T1細胞を注入したマウスよりも有意に長い総生存期間を示しました。

組織学的解析により、4T1および410.4の脳転移は明確な成長パターンを示し、4T1はコホート様、410.4は鎖状上皮浸潤性増殖を示しました。不適切な立体定位注射は細胞の懸濁漏れにより頭蓋骨および髄膜に腫瘍の成長を引き起こし、適切な皮質内注射では実質転移とその後の髄膜の転移を引き起こしました。脳転移の成長パターンが予後や神経死に影響を与えることを示し、臨床意思決定の指針としての重要性を支持しています。

このプロトコルは、特に後期転移性コロナゼーションの研究に有用であり、成長動態や二次播散といった臨床的に重要な側面に対処します。他の方法とは異なり、立体定位モデルは脳特異的な定着を促進し、システム全体の複雑さを維持できるため、腫瘍の進行と治療反応の長期研究を可能にします。再現性のある臨床的関連プラットフォームを提供することで、本モデルは脳コロニゼーションのメカニズムを理解し、新たな治療戦略の探求に貢献します。