CD63-GFPリポーターマウスモデルを用いた脂肪細胞由来細胞外小胞分泌の生体およびin vitroでの特徴付け

私たちは、脂肪細胞由来の細胞外小胞(EV)を研究し、脂肪組織における役割、特に成熟した脂肪細胞とその前駆細胞間のクロストークをどのように調節するかを明らかにします。現在、脂肪細胞EV分泌を研究するための生体内システムは存在せず、既存の精製プロトコルも完全に最適化されていません。まず、安楽死マウスから鼠径脂肪組織を無菌技術で切除します。

組織1グラムを2ミリリットルのチューブに、0.5ミリリットルの消化バッファーを入れます。滅菌ハサミを使って組織を1ミリメートル以下の細かい部分に刻みます。挽いた組織を、0.5ミリグラム/ミリリットルのリベラーゼおよび50単位/ミリリットルのDNase Iを含む消化バッファー10ミリリットルに懸浮させます。サンプルは軌道シェーカーで37度の環境で培養します。

孵化中は、チューブを優しく何度か逆さまにします。溶液が濁って見え、組織の断片が見えない場合、消化は完了します。間質血管分数(SVF)を単離するには、消化された懸濁液を2巻の消化バッファーで希釈します。

チューブを優しく3〜4回逆さにしてよく混ぜます。懸濁液を無菌の100マイクロメートルフィルターに通して未消化組織を除去し、その後300gで4度の温度で5分間遠心分離します。ペレットにはSVFとラベルを付けてください。

赤血球溶解バッファーの基質血管画分を、光から守って氷上で5分間キュベートします。洗浄バッファーを2巻加え、遠心分離機で400gで4度5分間加熱します。間質血管分画を1グラムあたり80マイクロリットルのバッファーに再懸濁し、内容物を新しいチューブに移します。

組織1グラムあたり20マイクロリットルの非脂肪細胞前駆除カクテルを加えます。サンプルを暗闇で2〜8度の温度で15分間孵化させます。サンプルをLSカラムに通し、系統陰性細胞分画を含む流出液を収集します。

300gの液体を4度の温度で5分間遠心分離し、脂肪細胞の前駆細胞を得ます。分離したマウス脂肪細胞前駆細胞マウス250マイクロリットをコラーゲン被覆の8ウェルチャンバースライドに6時間インキュベートします。細胞を4%のパラホルムアルデヒドで10分間固定し、画像撮影のために細胞および細胞外の小胞構造を保持します。

次に、PBSでスライドを3回洗い、その後アンチフェードメディウムでマウントします。次に、脂肪細胞の前身細胞を数えた後、それらを懸浮させて生存性染料を希釈します。光を遮って20分間氷で孵化させます。

洗浄バッファーと遠心分離機でセルを一度洗浄します。細胞を鮮やかな染色バッファーに懸浮させ、最終濃度が100マイクロリットルあたり100万細胞になるようにします。非特異的結合を阻害し、1対100の比率でFc受容体遮断試薬を加えてインキュベートします。

SCA-1抗体を6000gで4度摂氏で10分間フリースピンします。SCA-1抗体をAPCチューブに1から100の希釈で加え、その後、光から保護された氷の上に置きます。細胞を1ミリリットルの洗浄バッファーで2回洗浄し、その後300gで4度の温度で遠心分離機で5分間行います。

細胞をウォッシュバッファーに懸浮させてフローサイトメトリーの選別を行い、その後、紫と青のレーザーを備えたスペクトルフローサイトメーターでSCA-1陽性およびGFP陽性細胞のデータを取得します。区別を始めるには、0.2%ゼラチンを室温で30分間コーティングします。新たに分離したAPCを補給されたDMEM/F12培地に播種し、コンバーンに達するまで培養します。

1日目から8日目までは培地をMesenCultの脂肪生成分化培地に置き換えます。9日目には、PBSで2回脂肪細胞を洗浄し、その後DMEM 1%BSAおよび0.2%プリモシンを含む成熟脂肪細胞培養培地に交換します。脂肪細胞分泌の細胞外小胞を分離するには、まず15ミリリットルの培地を40マイクロメートルのフィルターに通し、その後30マイクロメートルのフィルターを通します。

ろ液を500gで5分間遠心分離し、その後2000gで上清液を10分間遠心分離して残留細胞やゴミを除去します。得られた上清液を0.8マイクロメートルのフィルターに通し、15ミリリットルの超時ろ過ユニットに移した後、4000gで遠心分離機で15分間濃縮します。濃縮サンプルを自動分画収集器に接続されたサイズ排除クロマトグラフィーカラムに積み込み、F1からF1までの分 F8.To 採取してウェスタンブロット分析を行い、各分画を400マイクロリットルから25マイクロリットルまで濃縮します。

ピペットで50マイクロリットルの放射免疫沈降アッセイバッファーにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加して濃縮液に注入します。2×SDSローディングバッファーを2枚75マイクロリットル追加し、4%から12%のトリスグリシンゲルで試料を変性させてタンパク質を分離します。ナノ粒子追跡解析では、細胞外小胞サンプルを0.1マイクロメートルのろ過済み無菌PBSで希釈し、優しく混ぜます。

希釈されたサンプルを、高感度の科学的補完金属酸化物半導体カメラと532ナノメートルのグリーンレーザーを搭載したNTA装置に搭載します。粒子の検出は10ナノメートルから1,000ナノメートルの範囲で、濃度は10の6乗から10の10の9の乗の粒子/ミリリットルの範囲に設定します。ストップフロックフロック/CD63GFPマウスの脂肪前駆細胞は、共焦点顕微鏡下で緑色蛍光タンパク質の点を検出できませんでした。

一方、AdipCD63マウスの細胞は細胞質全体に多数の異なる緑色蛍光タンパク質の点を示しました。フローサイトメトリー解析では、レポーターマウスの頭蓋骨1陽性細胞のうち1.2%が緑色蛍光タンパク質を発現し、AdipCD63-GFPマウスでは12.6%を下回りました。ウェスタンブロット法では、細胞外小胞マーカーのCD63およびHSP70がF1およびF2の区分で濃縮していることが示されました。小胞体やミトコンドリアのマーカーは見られず、膀胱の純度が確認されました。

ナノ粒子追跡解析により、脂肪細胞由来の細胞外小胞の大きさは50ナノメートルから500ナノメートルの範囲であり、透過電子顕微鏡で小胞が完全な二重膜構造を示すことが確認されました。ウエスタンブロットで脂肪細胞におけるSTX4のノックアウトが確認されました。共焦点顕微鏡では、野生型脂肪細胞ではCD63-GFP陽性小胞が細胞質全体に分散していましたが、STX4ノックアウト脂肪細胞では細胞膜付近に蓄積していました。

STX4ノックアウト型脂肪細胞では、野生型に比べて分泌される脂肪細胞由来の細胞外小胞の濃度が有意に低下しました。同量の細胞内小胞を西方ブロットしたところ、STX4ノックアウト脂肪細胞において野生型に比べてCD63およびCD81の発現が減少しました。このプロトコルは、生体内および体外で脂肪細胞EV分泌を研究するための堅牢かつ再現性の高いシステムと、最適化された脂肪細胞EV精製法を提供します。

このプロトコルは、成熟脂肪酸由来のEVを精製するための、連続低速遠心分離とサイズ排除クロマトグラフィーを組み合わせて初めて記述・検証しました。私たちの発見は、脂肪細胞が生理学的および病理的条件下で他の細胞種とどのようにコミュニケーションを取るかについて新たな疑問を投げかけることを可能にします。