ショウジョウバエメラノガスターに対するキセノン麻酔による高気圧システムの検証

私の研究は全身麻酔の仕組みを理解することを目指しており、高気圧条件下で麻酔となるガスはいくつかあります。このプロトコルにより、キセノンでショウジョウバエを麻酔し、全身麻酔の基本的なメカニズムを研究することができます。まず、各実験ごとに1〜3日齢の麻酔をかけた雌と雄のチョウジョウバエ20匹を採取し、実験前に約22度の温度で少なくとも24時間、餌と一緒に小瓶で休ませます。

実験用に、容器内のガスシリンダーから漏れ防止ガスバッグに移します。シリコーンチューブを使い、ガスシリンダーの出口をガスバッグの入口に直接接続し、ガスの移動を可能にします。25ミリメートルのシリコーンチューブをポリプロピレン注射器に取り付けます。

ポリプロピレン注射器をガスバッグと三方向蛇口に接続します。高圧装置を組み立てるには、まずLEDライトテーブルをテーブル上に横向きに配置します。インジェクションポンプをLEDライトテーブルの短い辺の隣に設置し、実験用シリンジがバックライトの上に伸びるように配置してください。

次に、75ミリメートルの長さのシリコンチューブを切ります。中央ノズルのシリコーンチューブを使って三方向タップをマノメーターに接続します。ノズルのマノメーター側と上部の三方向タップにホストスプリングクランプを使い、チューブがしっかり固定されていることを確認してください。

その後、注入ポンプ制御ユニットの二重矢印付きボタンで速度を80ミリメートル毎分、持続時間を38秒に設定し、自動圧縮または減圧を行います。次に、実験室の周囲光を制限し、LEDライトテーブルを点灯させます。映像のコントラストを上げるために明るさレベルを3に設定してください。

ポリカーボネート注射器からプランジャーを外してください。ハエの逃げを防ぐために、注射器の先端に少量の綿を入れます。40匹のフライをポリカーボネート注射器に移すには、バイアルの蓋を外し、注射器のバレルをバイアルの上に置き、アセンブリを逆さまにしてからタップしてフライを注射器のバレルに移します。

注射器のバレルのマークがカメラに向くように向きを変え、ハエの最適な視認性を図ります。調整可能なネジを使って、バレルとプランジャーヘッドの両方を注入ポンプに固定して注射器を固定します。次に、注射器の先端から綿を取り出し、注射器を三方向タップに接続します。

ビデオ撮影を始めろ。マノメーターをオンにし、ストップを回してマノメーターと注射器をつなげて、キロパスカル圧力ゼロを確認します。三方向タップを横方向に回して、注射器との空気交換を可能にします。

インジェクションポンプの手動制御オプションを使い、プランジャーを20ミリリットルの位置から2ミリリットルの位置に移動させます。ガスバッグから18ミリリットルの麻酔ガスをポリプロピレン注射器に吸引します。注射器を三方向タップの横ルアーロックポートに接続します。

その後、インジェクションポンプの手動オプションを使ってプランジャーを20ミリリットルの位置に戻します。ストップを回してマノメーターと注射器をつなぎ、圧力の読み取り値を観察します。プリセットの速度と持続時間設定で自動プランジャーの動きを始めます。

圧力を監視しながら、プランジャーが38秒で5ミリリットルに達するまで待ちます。プランジャーを5ミリリットルの位置に20秒置き、最大圧力を記録します。注射器で優しく叩いて、プランジャーに付着したハエを外し、底に落ち着かせます。

20秒後に自動減圧を開始します。プランジャーが20ミリリットルに戻ったら実験を終了し、漏れ制御のために最終圧力を記録します。動画編集のためにScreenFlowを起動してください。

各録画した映像を、注射器の最初の5ミリリットルに対応する関心領域にトリミングします。各動画は注射器減圧後の最初の20秒に切り分けます。動画をGIFとしてエクスポートして複製します。

次に、フィジーソフトウェアを起動して、異なる重複から最初と最後のフレームを削除します。順に画像をクリックし、動画編集、フレームを削除します。プロセス、バイナリをクリックし、各GIFファイルをバイナリにして、黒い背景に白いハエが見えるようにしてください。

フィジーで両方のバイナリファイルを開きます。プロセスと画像計算機を選択してピクセル差を計算し、ピクセル差ファイルを生成します。ピクセル差ファイルを保存した後、粒子を解析・解析し、ピクセルサイズのしきい値を調整して信号対雑音比を改善します。

フレームごとのピクセル差を含む生成されたCSVファイルを保存してください。データを活用してフレーム間の累積移動を計算し、統計的比較を行います。実験的なビデオは、ピクセル解析の準備としてバイナリ画像や差分画像に変換されて処理されました。

閾値調整がなければ、フレームごとにピクセル差が蓄積し、ベースライン信号は約20,000に上昇しました。ピクセルサイズの閾値を100から1000に適用することで、背景信号を減らし、フライの動きによる違いを強調しました。フレーム200まではフレームあたりのピクセル差値がほぼゼロにとどまりました。

YOLOv11 Nモデルは高い1フレームあたりの精度でフライを追跡しましたが、頻繁な遮蔽により過剰なフライ識別割り当てが発生しました。追跡の不整合により、ハエの移動は実験ごとの全IDの移動を合計し、最大200IDで正規化することで定量化されました。85%キセノンにさらされたハエは、90%や95%キセノンにさらされたハエよりも回復が速く、より多く移動しました。

私たちのプロトコルはシンプルかつ迅速であり、従来の圧力チャンバーよりも安価な材料を使用しています。最大圧力は約4気圧に制限されており、不完全なシールは徐々に圧力を失います。このセットアップにより、小型モデル生物における麻酔ガスの行動への影響を再現可能に測定できます。