デジタル顕微鏡を用いた綿の葉および苞片蜜の可視化によるスコアリング精度とデータ保存の向上

本研究は、蜜腺形質の発現を正確に評価する方法に焦点を当てています。蜜腺形質の表現を示すために、綿葉と苞葉の蜜腺の両方をモデル組織として用いました。この方法は、ネクタリートレードスコアリングにおいて信頼性が低く不正確である従来のスコアリングの制約を克服します。

まず、クーラーボックスとラベル付きのジップロック袋を温室に運び、サンプル採取を行い、2〜3ヶ月齢の温室で育てられた綿花の若い葉組織を採取し、ラベル付きのサンプル袋に入れます。採取後は、植物サンプルごとに少なくとも2枚の葉をラベル付きのサンプル袋に入れ、袋をしっかりと密封してください。葉組織入りの密封サンプル袋をクーラーに入れます。

植物が開花の中間段階にあるときに、上の枝から健康な花を集めましょう。少なくとも2本の花をラベル付きのサンプル袋に入れ、袋を密封してください。花の入った密封されたサンプル袋をクーラーに移し、実験室へ運びます。

顕微鏡をつけて、初期の起動手順を進めてください。顕微鏡ステージのサイズに合わせて半折りたたみしたA4の白いシートをステージに置きます。コンソールコントローラーの小さなライトノブを使って顕微鏡ステージの光を最大強度に調整します。

次に、大きな明るさノブを3/4回転させて中高に設定します。コンピュータでは顕微鏡ソフトで10倍の倍率を選択します。葉組織をあらかじめ切り出した白いシートの上に、背面を上に向けて置き、ステージの中央に置きます。

コースを優しく回転させ、微調整ノブを葉の中央肋骨に集中させます。画像がはっきりしてぼやけなく見えるまで調整を続けてください。蜜が位置する肋骨の下端を視野の中央に位置させ、分岐する側脈をはっきりと見せるようにしてください。

コース調整ノブや微調整ノブを使い、ピントをさらに細かくしてデジタル画像の鮮明さを向上させます。蜜腺の画像を撮影してください。ソフトウェアの指示があれば、サンプル識別番号を指定された場所に保存し、観察した葉の蜜腺表現型に基づいて1から4までのスコアを割り当てます。

苞葉をピンセットや手で取り除いてください。花をきれいなまな板の上に置きます。滅菌された刃で花の茎を切り取り、取り除いた苞片の縁に沿ってまっすぐに切開します。

用意した花の組織を、現微鏡ステージのあらかじめカットされた白いシートの上に逆さまに置きます。画面に表示される画像の鮮明さを向上させるために、コースや微調整ノブを使いましょう。適切なサンプル識別番号とともに画像を保存してください。

中央肋骨下部の葉の背面面のデジタル画像スコアリングでは、2つの表現型が確認され、そのうち1つは中央肋骨に蜜腺がないスコアでした。そして、蜜が入った完全に発達した蜜で4つを得ました。花のサンプルをブラクテアの蜜腺の解析で分析したところ、2つの表現型が観察され、スコア1は蜜腺なし、スコア4は完全に形成された蜜腺が蜜を産生していることを示しました。

蜜腺植物のデジタル画像では、10倍、20倍、40倍の倍率で葉と苞片の蜜構造が明確に示されました。標準的なスコアリング形式に対応する選択された葉のデジタル画像では、蜜腺が欠如したスコア1、未発達の蜜でスコア2、小さな蜜でスコア3、完全に発達した蜜腺でスコア4が示されました。蜜を含まない植物を、蜜腺のない植物と蜜腺のない交配種の分離集団から正確にスコアリングすることは、植物の害虫被害を減らし収量損失を減らすために不可欠です。

したがって、この形質の選択は、ネクタリーレス形質に関連するDNAマーカーのような後継的な応用において重要であり、マーカー補助選択の有用なツールとなります。