マイクロインジェクションを使用してアブラムシのウイルス伝播の生理学的障壁のテスト

もしそれらが植物ウイルスの効果的な媒介者であるならば、ウイルスの微量注入を行う必要があります。本日ご紹介する手順は、循環方式でのウイルス伝播における2つの主要な障壁の一つである腸をバイパスして、AFibの血球細胞に直接ウイルスを注入することを可能にする技術です。こんにちは、コーネル大学植物病理学部のポストドクター、Cecilia Tamrin Dehiです。今日は、AFibの血球細胞にウイルスを注入する方法を実演します。これにより、ウイルスを異なる植物種に伝播させることが可能になります。

例えば、このFE植物はPLRV（ジャガイモ葉巻ウイルス）に感染しています。健全な植物と感染した植物の違いを確認できます。最も顕著な症状は、葉脈の硬化（sclerosis）です。

PLRVは、哺乳類の血液に相当する昆虫の血リンパ中に運ばれるルテウムウイルスです。非感染のAPHISが感染植物を吸汁すると、ここで見られるように植物の汁液を介してウイルスに感染します。摂取されたウイルスは、昆虫の腸から血リンパへ移行し、さらに唾液腺を通過することで、再びESE植物へと伝播されます。

ESE植物を吸汁する際に多くのウイルスを取り込んだとしても、腸と唾液腺を通過できるのはごく一部に過ぎません。これらが、より多くの植物に感染させて試験するための伝播における2つの主要な障壁となります。アフィドがウイルスを媒介できるかを確認するため、アフィドを感染組織で2日間吸汁させた後、健全な植物に5日間吸汁させます。

その後、植物を燻蒸し、3週間後に症状の確認を開始します。ウイルスを媒介できないAFibが見つかった場合、マイクロインジェクション法を用いて、2つの障壁のどちらがウイルスの感染を阻止しているかを評価できます。本日はこの手法をご紹介します。この手順では、ウイルスを血腔に直接注入し、腸管伝播障壁をバイパスさせます。

それでは、apexのマイクロインジェクション方法について説明します。こちらが使用するガラス針です。これらのガラス針は、APUを用いてこのガラスシールドから引き伸ばして作製します。

これがマイクロインジェクターです。ウイルスをマイクロインジェクションするために、ニードルをニードルホルダーに装着します。

針をセットし、適切な位置に配置します。次に、このヘルメットの上部にある針にウイルスを充填します。これで、マイクロインジェクションのためにAFIを配置する必要があります。

そこで、痛み圧力（pain pressure）を伴うアブラムシを1匹取り、それをアブラムシホルダーに設置します。理想的には、アブラムシの背面をホルダーに密着させ、腹部へのアクセスを確保できるように配置します。はい、これで完了です。

それでは、マイクロインジェクションを行います。針を配置し、AFibに近づけます。次に、針をAFibに接触させます。外骨格を貫通させるには、脚の付け根にある節の間を狙って刺すのが最適です。

それでは、注入を行います。ブラシでAFIを採取し、回収用ペーパーに移して、しばらくの間回収させます。また、コントロールのAFIについてもマイクロインジェクションを行う必要があります。

このコントロール微量注入は、ウイルスを含まないバッファーのみを用いて行います。使用するバッファーは0.1 M リン酸バッファー pH 7です。まず、健康な植物にアフィドを配置し、5日間的に付着させます。その後、植物に給餌し、症状の発現を待ちます。下鎖NAの微量注入後1週間にわたり、毎日アフィドにおける標的遺伝子の発現レベルを測定します。

このようにして、ウイルスを伝播させることができなかったアフィドにマイクロインジェクションを行いました。マイクロインジェクション後にこのアフィドがウイルスを伝播させることができれば、このアフィドにはウイルスを遮断する腸管バリアが存在していたことを意味します。一方で、症状が現れない場合は、このアフィドが強力な唾液腺バリアを持っていることを意味します。

以上で、アブラムシへのウイルスのマイクロインジェクション方法について説明しました。同様の手順を用いて、二本鎖RNAをアブラムシにマイクロインジェクションし、RNAi（RNA干渉）を行うことができます。これは、アブラムシの遺伝子機能を研究する上で非常に有用な手法です。マイクロインジェクションについての説明は以上です。

このビデオがお役に立ち、皆様の実験に活用していただければ幸いです。ありがとうございました。