空間トランスクリプトームデータ解析の実践的ワークフロー：データ取得から高度な解析まで

皆さん、こんにちは。このビデオでは、データの取得と読み込みから、基本的な探索、そして最終的な高度な解析まで、空間トランスクリプトーム解析の実際的なデータ解析パイプラインについて解説します。全体として、ワークフローは主に3つのステップで構成されています。

まず、データのダウンロードを行い、次に解析コードを入手し、最後にパイプラインを実行して結果を生成します。ステップ1では、データの取得とディレクトリ構造の準備を行います。まず、公開されている空間トランスクリプトームデータセットを入手します。

rawデータのアーカイブをダウンロードします。そして、アーカイブを解凍します。ファイルを標準化されたディレクトリ構造に整理します。

まず、メインのデータディレクトリを作成し、次に各サンプル専用のサブディレクトリを作成します。各サンプルの必須ファイルを、それぞれのサブディレクトリに転送します。その後、各サンプルディレクトリ内に空間（spatial）サブフォルダを作成してください。

以下のファイルをspatialサブフォルダに配置します。フィルタリング済みのfeature PC metrics S1ファイルをサンプルのメインサブディレクトリに配置します。spatialフォルダ内のgzipファイルを展開します。

元のファイル名がload 10X spatial関数の要件と完全に一致していることを確認してください。ステップ2は、ソフトウェア環境のセットアップです。ここではR言語のインストールは省略し、GitHubリポジトリから解析スクリプトを取得する工程から説明を開始します。

ファイルコンダクター内にあるGrahamからの必要なRパッケージを、setup Rスクリプトを実行してインストールします。公式ドキュメントシートに記載されているインストールコマンドを実行し、auto suitをインストールします。公式のインストールURLにアクセスし、セットアップスクリプトを取得してください。セットアップページの指示に従い、必要なPython環境とシステム依存関係を初期化します。

GitHubリポジトリにアクセスしてカスタムツールを入手し、ソースコードをダウンロードします。TOSディレクトリに移動し、Pythonの依存関係をインストールします。ステップ3では、空間データの読み込みと品質管理を行います。

空間データをSeuratオブジェクトに読み込みます。read 10X imageを使用して、高解像度の組織画像を手動でロードします。その際、画像ファイルのパスと画像名を指定してください。

imageパラメータに前ステップで作成した画像オブジェクトを設定し、load 10X spatialを使用してSeuratオブジェクトを作成します。品質管理指標を算出します。percentage feature setを用い、パターンをmtに設定してミトコンドリアリードの割合を計算します。

QC指標に基づいてデータを可視化し、解釈します。バイオリンプロット関数を用いて、nCount_Spatial、nFeature_Spatial、およびpercent.mtのバイオリンプロットを生成します。

空間的特徴プロットを用いて、これらの指標の空間的特徴プロットを作成します。そして、組織領域外のスポットを特定します。オプションとして、低品質のスポットを除去するためのフィルターを適用します。

スクリプトを実行すると、QCメトリクスや特徴量の空間プロットを含むこれらの結果を得ることができます。ステップ4は、データのプリプロセッシング、統合、およびクラスタリングです。個別のサンプルのプリプロセッシングにおいて正規化を行います。

Spatialアッセイを用い、各サンプル個別にSC transform正規化を適用します。複数のサンプルを統合します。統合のために、SCTransform正規化済みオブジェクトのリストを準備します。

空間アッセイをコピーして、各オブジェクトにRNAアッセイがあることを確認します。PREP SCTインテグレーションにおいて、select integration featuresを用いて共通の変動特徴量を特定します。正規化手法にSCTを指定して、find integration anchorsを用いてインテグレーションアンカーを検出します。

IntegrateDataを用いてデータを統合します。統合されたアッセイでクラスタリングのための次元削減を行います。runPCAを使用して、統合データに対してPCAを実行します。

累積寄与率を算出することで、下流解析に用いる主成分の最適な数を決定します。プログラムを用いてエルボー点（変曲点）を特定してください。決定した主成分数を用いてUMAPを実行します。

FindNeighborsおよびFindClustersを用いて細胞のクラスタリングを行います。決定したPCを指定し、resolutionを0.5に設定します。FindMarkers関数を用いて、ターゲットグループ間の差分発現解析を実施します。

空間的に変動する遺伝子を特定します。各オリジナルサンプルについて、SCTアッセイでMoran's I法を用いてfind spatially variable featuresを実行し、空間的自己相関を算出します。このスクリプトを実行すると、エルボープロット、UMapプロット、クラスタープロット、クラスターマーカーのヒートマップ、ボルケーノプロット、空間的特徴を持つ差異発現遺伝子、空間的に信頼性の高い遺伝子、および結腸層マーカーを取得できます。

そして、結腸層マーカーのドットプロットと、空間的特徴プロットにおけるマーカーです。ステップ5、単一細胞リファレンスデータのプリプロセッシング。read 10Xを用いて単一細胞RNA-seqカウント行列を読み込み、Seuratオブジェクトを作成します。

標準的なQC正規化およびデクラスタリングを行います。フィルター後の細胞におけるミトコンドリアリードの割合を算出します。SC transformを用いてデータを正規化します。

vara.to.を設定し、percent.mt.を回帰させます。PCAおよびUMapを実行し、前のステップで説明した動的PC選択法を用いて細胞をクラスタリングし、その後、細胞型をアノテーションします。

AddModuleScoreを使用して、標準的な細胞型マーカー遺伝子のモジュールスコアを算出します。モジュールスコアと既知の生物学的知見に基づいてクラスターをアノテーションします。あるいは、メタデータから事前に計算されたアノテーションをインポートすることも可能です。

このスクリプトを習得することで、QC指標を取得できます。クラスターごとのUMap、サンプルごとのUMap、および細胞型スコアがアップロードされています。ステップ6は、SPOTlightを用いたリファレンスガイド下デコンボリューションです。

まず、SPOTlight用のデータを準備します。アノテーション済みのシングルセルSeuratオブジェクトと空間的Seuratオブジェクトを、single-cell experimentオブジェクトに変換します。LogMoreCountsを用いて、シングルセルデータをログ正規化します。

次に、SPOTlightデコンボリューションを実行します。まず、ModelGeneVarを用いて単一細胞データの高変動遺伝子を特定します。その後、スコアマーカーを用いて細胞型マーカーを算出し、高品質なマーカーでフィルタリングを行います。

計算時間を短縮するため、各細胞型のシングルセルリファレンスを管理可能な数までダウンサンプリングします。SPOTlight関数を用いてデコンボリューションを実行し、シングルセルリファレンス、空間データ、マーカーリスト、およびHVGを指定します。その後、結果を可視化およびエクスポートできます。デコンボリューションの結果は、図に示すようなスキャッターパイプルートとして取得できます。

ステップ7では、Stdeconvolveを用いた教師なしデコンボリューションを行います。まず、空間データを準備します。countsスロットを指定してGetAssayDataを使用し、空間Seuratオブジェクトから行カウントメトリクスを抽出します。

STdeconvolveから得られたクリーンカウントを用いて、低品質なスポットおよび遺伝子を除去します。restrict strict LDAを用いて、4つの遺伝子が最小スポット分率で発現しているフィルターの潜在的な細胞型を特定し、fitLDAを用いて広範なトピック数にわたる割り当てモデルを適用します。opt minを用いた最適モデルにより、最小の複雑性に基づいて最適なモデルを選択します。

結果を分析し、可視化します。getBetaThetaを用いて、最適モデルの血清型比率（Theta）および遺伝子プロファイル（Beta）を抽出します。腐食トピックの生物学的解釈を加えるには、select spatial spotツールで作成した関心領域（ROI）のアノテーションをインポートしてください。

これらのアノテーションを「with all topics」機能のグループパラメータとして使用してください。デコンボリューションされた細胞型の割合を空間座標にマッピングし、ROIごとにスポットを色分けしてプロジェクトに反映させます。スクリプトを実行すると、SPOTlightで生成されるものと同様の、スケールパイプロードのような結果が得られます。

ステップ8、Giottoを用いた空間的な細胞間相互作用の解析です。まず、SeuratオブジェクトをGiottoオブジェクトに変換します。createGiottoObject関数を使用し、低カウント指標と空間座標を指定してください。

Giottoオブジェクトの前処理を行い、デコンボリューションの結果を追加します。normalized Giottoを使用してデータを正規化し、セロタイプ注釈として追加します。addCellmetadataを使用して細胞メタデータを選択します。

createSpatialNetworkを用いて空間ネットワークを作成します。リガンド受容体データベースを環境にロードします。explore CellCellcomを実行し、空間的に近接している細胞タイプ間の有意なリガンド受容体相互作用を特定します。

このようにして、細胞間コミュニケーションのドットプロットを取得できます。ステップ9は任意です。SelectSpatialSpotを用いたインタラクティブなスポット選択を行います。

スクリプトsixを用いて、インタラクティブツールのためのデータを準備します。GetTissueCoordinatesを使用して、Seuratオブジェクトから空間座標を抽出します。データを整形し、エクスポートします。

整形したデータフレームをCSVファイルにエクスポートします。次に、関心領域（ROI）解析を行います。カスタムプログラムを起動してください。

Spatial Spots Dashアプリケーションを選択し、CSVファイルを読み込みます。空間的な位置に基づいてスポットをインタラクティブに選択します。その後、選択したスポットのリストと割り当てられたグループを、新しいCSVファイルとしてエクスポートします。

スクリプトを一つずつ実行して、どのような結果が得られるかを確認します。すべての結果は results five-fold に保存されます。ご覧の通り、QCメトリクスと divide を取得できます。

こちらの空間的特徴プロットで確認できます。さらに、デコンボリューション処理は教師ありおよび教師なしの両方の手法で行われています。SPOTlightの結果はこちらです。

ご覧のように、すべてのスポットに比率情報が含まれています。ここでは、STdeconvolveによる教師なしデコンボリューションの結果も生成されています。また、これは空間データにおけるスポットのSeuratクラスターの結果です。

また、このように空間チームプロットで可視化することも可能です。さらに、Giottoを用いてスポット間コミュニケーションの結果を得ることもできます。このワークフロー全体は100%オープンソースです。

発現指標から高度な空間モデリングに至るまでのスポット解析。すべての工程はRAM 16GBのマシンで動作します。コードベースはモジュール方式で、タスクごとに1つのスクリプトが割り当てられています。

なお、このパイプラインはFASTQファイルからのアップストリーム処理は含んでいないことに注意してください。重点は2D空間データに置かれており、現在はVisiumのダウンローダーのみを搭載しています。以上です。ご視聴ありがとうございました。