薬物治療後の肝細胞癌オルガノイドの生成および単細胞トランスクリプトミック解析

HCCオルガノイドが薬物治療にどのように反応するか、そしてそのトランスレーショナル研究が職場でどのように変化するかに焦点を当てています。このプロトコルはHCCオルガノイドに有用であり、他の腫瘍オルガノイドシステムにも適応可能です。まず、肝細胞がんまたはHCC患者由来のオルガノイドを確立し、治療的摂動のために準備します。

レンバチニブのストック溶液は、製造元の指示に従ってジメチル硫酸(DMSO)で調合してください。使用直前に、凍結液を予温培養培地であらかじめ定めた作業濃度まで希釈します。すべてのウェルで最終体積が均等になるよう十分な溶液を準備し、各ウェルで同じDMSO濃度を確保します。

次に、各ウェルの壁に沿って20マイクロモルのレンバチニブ含有培地を加え、マトリックスドームを乱さないようにします。同じ最終DMSO濃度を持つ車両制御装置も含めてください。オルガノイドを標準培養条件下で、あらかじめ定められた処理期間にインキュベーションします。

72時間を超える処理の場合は、48〜72時間ごとに薬剤含有培地を交換し、すべてのウェルで一貫した交換スケジュールを確保してください。治療前に明視野の基準画像を記録してください。同じ顕微鏡設定、倍率、視野位置を用いて、治療中は一定間隔で画像を取得します。

形態学に基づく治療反応評価には、すべての画像に対して同一の露光設定、拡大率および分析閾値を用いてください。各時刻点における井戸またはフィールドごとの総オルガノイド面積を計算し、基準値に正規化してオルガノイド面積成長曲線を測定します。平均オルガノイド直径を測定するには、個々の完全なオルガノイドの直径を測定し、井戸ごとの平均値を計算します。

次に、形態学的に識別可能な完全なオルガノイドを数え、破片や崩壊した破片を除外して生存するオルガノイド数を決定します。製造元の指示に従って追加のバルク生存評価が必要な場合は、治療エンドポイントで三次元発光生存性アッセイを実施してください。次に、オルガノイド面積の成長曲線を時間経過でプロットします。

車両処理群とレンバチニブ処理群の平均オルガノイド直径を比較します。また、処理群間で生存するオルガノイド数を比較してください。再現性を確保するために、一貫した画像スケジュール、選択基準、解析パラメータを用いること。

3D形態が完全なオルガノイドウェル、単一細胞捕捉に十分な材料、目に見える汚染がないオルガノイドウェルを選びます。分離前に同一の顕微鏡設定、倍率、視野選択基準を用いて、各選択対象の明視野画像を記録します。対照群と処理群の一致した時間点でオルガノイドを採取しつつ、すべてのサンプルで同一のプレート密度、処理スケジュール、中間置換条件を維持します。

各ウェルから培養培地を完全に吸引してください。各井戸を氷冷PBSで2回洗い、残留中の培地やゴミを取り除きます。各ウェルに氷で冷たい細胞回収液を1ミリリットル加え、氷上で20〜30分間培養します。

培養中はマトリックス溶解を促進するために、5〜7分ごとに優しくピペットを動かします。溶解物質を広口または切断したピペット先端で予備冷却されたチューブに移し、切断応力を最小限に抑えます。マトリックスがほぼ溶解し、最小限の目に見えるゲル残基が残った後にのみ酵素解離を進めます。

回収したオルガノイド懸濁液を300Gで4度の温度で5分間遠心分離します。ペレットを乱さないように上清液を慎重に除去してください。ペレットを組換え細胞解離酵素1ミリリットルに再懸浮させ、37度で5〜10分間培養します。

ピペットを2〜3分ごとに8〜10回、広口径のP1000チップを使って優しく擦り、解離を促進します。ほとんどのオルガノイド断片が単一細胞に分散し、小さな残留クラスターだけが残った時点で消化を止めます。次に、2%の胎児用牛血清を含む氷で冷たくしたPBSを4ミリリットル加えて消化を止めます。

その後、40マイクロメートルのセルストレーナーで懸濁液をろ過します。残留酵素や凝集体、ゴミを除去するためにPBSで一度洗ってください。トリパンブルー排除を使って細胞数を数えます。

細胞の生存率が85%以上であることを確認した後、最終的な細胞濃度を1マイクロリットルあたり700〜1,200細胞に調整します。過剰な破片、豊富な死細胞、大きな目に見える集合体、または不完全な解離のあるサンプルは除外してください。骨材がある場合は、装填前に再度ろ過してください。

解離酵素、消化時間、ピペッティング頻度、ろ過方法、細胞濃度、ロード戦略を含む同一条件下でのプロセス制御および処理サンプル。最後に、単一セルライブラリ増幅後、単一セルシーケンスを行います。オルガノイドは回復後1日目から6日目まで、標準的な三次元培養条件下で生存し、増殖しました。

初日目にはオルガノイドは小さくコンパクトな構造として現れましたが、6日目にはサイズが大きく、形態が明確に現れました。レンバチニブ処理オルガノイドはDMSO処理対照群に比べてより小さく、形態変化を示しました。定量解析では、レンバチニブ治療後の平均オルガノイド直径がDMSO対照群と比較して減少していることが示されました。

このプロトコルにより、治療後の細胞状態、細胞組成、遺伝子発現の変化を研究することができます。最大の課題は細胞の生存率を維持し、すべてのグループ間で単純な処理を一貫させることです。この手順に従って細胞の下流解析が行われ、クラスタリング、差異遺伝子実験解析、経路富裕解析、トレジャリー推論などが含まれます。