ペプチドアレイおよびネイティブヌクレオソームプルダウンによるヒトスピンドリンファミリーメンバー4(SPIN4)の結合基質としての修飾ヒストンの同定

SPIN4は骨の発達を調節するヒストンリーダーです。SPIN4変異は過剰増殖を引き起こしますが、その病原性の役割は依然として不明です。このプロトコルは、ヒストン結合タンパク質の結合基質をあらゆる空間で研究するために適応・適用可能です。

まず、ブロッキングバッファーを5グラムの牛血清アルブミン(BSA)を重量し、100ミリリットルのBC-150タンパク質貯蔵バッファーに溶かして準備します。次に、疎水性ペンを使ってペプチドアレイ上の反応領域を描き、試薬を保存します。次に、15センチのペトリ皿にフィルターペーパーを入れ、水で湿らせます。

アレイを湿らせたフィルターペーパーの上に配置し、各アレイエリアに300マイクロリットルのブロッキングバッファーを慎重に加えます。ペトリ皿を蓋をして室温で1〜3時間孵化します。組換えFLAGタグ付きSpindlin-4(またはFLAG SPIN4タンパク質)を1マイクロモルと1つのFLAGペプチドコントロールをブロッキングバッファーで準備します。

試薬とアレイアンテナを冷蔵室に移して、背景音を減らし、信号対雑音比を改善しましょう。配列から余分なブロッキングバッファを削除してください。各ブロックにFLAG SPIN4タンパク質、またはFLAGペプチドコントロールを加えます。

ペトリ皿は冷蔵室で一晩孵化させるために蓋をかぶせてください。ウォッシュボックスにペプチドアレイウォッシュバッファー50ミリリットルを加えます。アレイからタンパク質溶液を捨て、反応面を上にしてウォッシュバッファーに移します。

陣を5回洗え。最初の2回の洗浄をそれぞれ1分間行い、その後に3回それぞれ5分間の洗浄を行います。その後、ブロッキングバッファーで洗剤の残留を洗い流します。

陣をペトリ皿に戻してください。各ブロックに300マイクロリットルの抗FLAG抗体を加え、室温で1時間培養します。抗体溶液を廃棄し、アレイをウォッシュバッファーに移し、前述の洗浄を繰り返します。

各ブロックにHRP結合ヤギ抗マウスIgG二次抗体溶液300マイクロリットルを加え、室温で1時間培養します。抗体溶液を捨て、前述のように配列を5回洗浄します。アレイを透明なシートプロテクターの中に置き、1ミリリットルの強化化学発光(ECL基材)を加えて均一なカバーを確保します。

閉じ込められた気泡を取り除きましょう。デジタルイメージャーを用いて明視野画像で化学発光を捉えます。生データファイルをMODified済みのヒストンペプチドアレイ解析ソフトウェアにアップロードした後、スポットアライメントタブで各グリッドがペプチドスポットを中心に置かれていることを確認します。

スポット統計では、重複スポット相関を確認し、誤差が5%未満であることを確認しましょう。反応性タブを使って、さまざまなヒストン修飾間の結合を評価してください。次に特異性タブを使って、異なるヒストン修飾間でのターゲットペプチドの相対的な結合傾向を調べます。2倍ビーズブロッキングバッファーを準備するには、10ミリリットルのBC-150溶解バッファーにBSA1グラムを加え、ボルテックスで溶解させます。

等モル濃度を含むFLAG SPIN4野生型とFLAG SPIN4 D82H変異ビーズを別々の1.5ミリリットル管に移す。野生型サンプルに、100ミリモラー1X FLAGペプチド陰性対照ビーズを同量に加えます。適切な量のBC-150溶解バッファーを使って、すべてのサンプルを均一な体積に調整します。

各チューブに2倍のビーズブロッキングバッファーを等量に加え、最終体積を1ミリリットルにします。4度・20回転に設定されたチューブローテーターで一晩孵化します。ヌクレオソーム結合を開始するために、氷の上で抽出したHEK293FT細胞から抽出した1Xのモノヌクレオソームを解凍します。

初期最適化のために、1XヌクレオソームとSPIN4タンパク質の1モル比を1分の1に計算します。1個のヌクレオソームと2つのビーズブロッキングバッファーを同じ体積で混ぜます。その後、混合物をあらかじめブロックされたビーズと15ミリリットルのチューブで混ぜ、チューブローテーターで4時間、4度摂氏、20回転で複合体化します。

3000Gで4度の温度で3分間遠心分離します。上清液を捨てた後、ビーズを1ミリリットルのBC-150溶解バッファーに再懸浮させ、1.5ミリリットルのチューブに移します。ビーズを3回洗うには、3000Gで1分間遠心分離機をかけます。

上澄液を捨てた後、ペレットを1ミリリットルのBC-150溶解バッファーに再懸浮させます。繰り返し洗う間にビーズの均一な分布を保つために、時折チューブを攪拌してください。その後、再懸濁と遠心分離の間に回転子を20回転、4度の温度で10分間のインキュベーションステップで2回洗浄します。

最終洗浄後、ビーズをBC-150溶解バッファーの9カラムに再懸浮させます。各サンプルから160マイクロリットルのビーズと40マイクロリットルの5倍レームリバッファーを混ぜます。変性のために95度で5分間加熱します。

オプションとして、背景を低減してよりクリーンな結果を得るために、タンパク質・ヌクレオソーム複合体のFLAGペプチド錯視を行うことも可能です。室温で3000Gの遠心分離機で5分間使います。次に銀染色とウェスタンブロッティングを行い、修飾ヒストンのSPIN4結合を検証・検出します。

SPIN4はヒストンH3リジン4(H3K4)、モノメチル、ジメチル、トリメチルペプチドに有意に結合します。逆に、SPIN4 D82H機能喪失変異体はすべての標的への結合が減少し、Tudorドメイン1が基質結合に不可欠であることを確認しました。SPIN4の結合親和性は、H3R2me2sやH3R2me2aなど他の翻訳後修飾によって悪影響を受けています。

一貫したペプチドアレイ観察の結果、SPIN4 D82Hは野生型SPIN4に比べてヌクレオソーム結合の全体的減少を示しました。SPIN4およびSPIN4 D82Hのプルダウンサンプルを比較したウェスタンブロット解析では、SPIN4 D82Hがモノメチル、ジメチル、トリメチルH3K4ペプチドに定量的に結合していないことが示され、翻訳後のヒストン修飾基体を迅速に同定するためのこれらの二重アプローチが検証されました。ヒストン結合タンパク質の結合基質の迅速かつ的確かな検証。

各候補のヒストン結合タンパク質の発現および精製に必要な条件は異なる場合があります。ネイティブモノヌクレオソームプルダウン後のヒストン質量分析により、ヒストンPTMの全範囲が得られます。