キメラ抗原受容体および治療用抗体によって増強されるNK細胞毒性の定量化:生細胞イメージングおよびフローサイトメトリー

当研究室では、健康状態および疾患におけるナチュラルキラー（NK）細胞の役割を研究しており、固形がんおよび血液がんの治療を改善するためにその潜在能力を活用することを目指しています。既存のNK細胞細胞毒性アッセイは、プラットフォームや設定間での標準化が不足しています。本プロトコルでは、正確な細胞毒性評価のための、再現性のあるライブセルイメージングおよびフローサイトメトリーの手法を提供します。

まず、15 mLコニカルチューブ内でSYTOX Orangeストック溶液をNK-92培養培地で希釈し、2x SYTOX Orangeを10 mL準備します。トリパンブルーで混合後、Luna Counterを用いて標的細胞を計数するか、あるいは検証済みの染料排除法による細胞計数法を用いて計数してください。必要な量の標的細胞を15 mLコニカルチューブに移します。

チューブを室温で300Gにて5分間遠心分離し、上清を廃棄します。その後、標的細胞を2X SYTOX Orange培地で最終濃度250,000 cells/mLになるように再懸濁します。エフェクター細胞を準備するには、NK-92細胞の生存率と濃度を評価し、生存率が80%を超える場合のみ工程を進めてください。生存率が低いと、アッセイの性能に影響を及ぼす可能性があります。

NK-92細胞を計数し、必要な細胞数を個別の15 milliliter円錐底遠心チューブに移します。遠心分離後、最終濃度が500, 000 cells/milliliterになるように細胞を再懸濁します。エフェクター細胞の希釈液を準備するため、エフェクター細胞対標的細胞比を2:1とする96ウェル丸底プレートのウェルに、エフェクター細胞を240 microliters加え、残りのウェルには培地を120 microliters加えます。

エフェクター細胞とターゲット細胞の比率を2:1、1:1、0.25:1とする2倍段階希釈を行い、ピペッティングを少なくとも5回繰り返して十分に混合し、移送のたびにチップを交換します。次に、共培養を準備するため、ポリリシンでコーティングされた平底96ウェルプレートを用意します。細胞を移送する直前に、気泡が入らないようにターゲット細胞とエフェクター細胞を十分に再懸濁させ、各細胞懸濁液を100 µLずつ適切なウェルに添加します。

次に、周囲の未使用のウェルに200 µLのPBSを加えます。プレートを室温で100G、2分間遠心分離します。その後、プレートをライブセルイメージングシステムに設置します。

37°C、5% carbon dioxide の条件下で、24時間にわたり1時間ごとに画像を撮影します。最初のスキャン後に画質を確認し、必要に応じてイメージング設定を調整してください。SYTOX Orange のグリーンチャンネルへの漏れ込みを補正するため、スペクトラルアンミキシングを調整します。

オレンジ陽性の死細胞がグリーン陽性細胞として誤認されていないことを確認します。浮遊細胞の個々の解析を構成するには、想定されるオブジェクト径を細胞の近似径である15 micrometersに設定します。閾値感度（threshold sensitivity）とテクスチャ感度（texture sensitivity）を5に、エッジ感度（edge sensitivity）を10に設定し、細胞クラスターの分離を容易にします。

デブリや大きな物体を除外するため、許容オブジェクト領域のフィルター範囲を 50 から 2,000 square micrometers に設定します。非細胞状の物体を除外するため、離心率の最大値を 0.95 に設定します。16 から 24 時間培養したヒト primary NK 細胞を用意します。

500,000個の標的細胞を15 mLのコニカルチューブに移します。PBS 10 mLで細胞を1回洗浄します。室温で300G、5分間、遠心分離を行います。

次に、上清を除去します。5 mMのCFSEストック溶液を1 µL、10 mLのPBSで希釈し、0.5 µMのカルボキシフルオレセイン・サクシニミジルエステル（CFSE）作業溶液を調製します。得られたペレットを、CFSE溶液を用いて細胞密度約1 × 10⁶ cells/mLで再懸濁します。

光を遮断するため、アルミホイルで包み、37 °Cで15分間細胞をインキュベートします。次に、5〜10倍量の培地を加えて反応を停止させ、37 °Cで5分間インキュベートします。細胞を遠心分離した後、100 µLあたり25,000個の細胞が含まれるように、細胞ペレットを250,000 cells/mLに再懸濁します。

マルチチャンネルピペットを使用して、ラウンドボトム96ウェルプレートの指定のウェルに、標的細胞を1ウェルあたり100 µLずつ分注します。各条件を3連（triplicate）でプレートします。次に、各テスト抗体および対応するアイソタイプコントロールについて、NK細胞培養培地で4X抗体溶液を200 µLずつ調製します。

抗体溶液をディープウェルプレートに移します。標的細胞を含む各ウェルに抗体溶液を50 µLずつ加え、ピペッティングで少なくとも5回上下に混ぜて十分に混合します。抗体未添加のコントロールウェルには、NK細胞培養液を1ウェルあたり50 µL加え、ピペッティングで十分に混合します。

標準的な培養条件下で、プレートを25〜30分間インキュベートします。NK細胞をカウントして200,000個分を回収し、生存率が75%以上である場合にのみ次へ進みます。細胞をprimary human NK cell culture 800 µLを用いて、1 mLあたり250,000個になるように再懸濁します。対応するウェルにNK細胞を1ウェルあたり50 µLずつ加え、ピペッティングで5回以上上下に混ぜて十分に混合します。

次に、コントロールウェルに培養液を1ウェルあたり50 µLずつ分注し、十分に混ぜ合わせます。ラウンドボトム96ウェルプレートを注意深く点検し、すべてのウェルに200 µLが入っており、液面（メニスカス）が均一で気泡がないことを確認してください。プレートを100Gで2分間遠心分離し、その後、標準的な培養条件下で16〜18時間インキュベートします。

プレートを300Gで5分間遠心分離し、上清を除去します。すべてのウェルを、1ウェルあたり200 µLの蛍光活性化細胞選別（FACS）バッファーで洗浄します。ここに示す方法で、FACSバッファーを用いて表面抗体マスターミックスを調製します。

各ウェルに50 µLの抗体マスターミックスを加え細胞を再懸濁し、ピペッティングで少なくとも5回十分に混ぜ合わせます。光を遮断するためアルミホイルで包み、プレートを4 °Cで15分間インキュベートします。その後、各ウェルに150 µLのFACSバッファーを加えます。

遠心分離後、各ウェルに100 µLの5 µM DAPI含有FACSバッファーを加え、細胞を再懸濁します。事前インキュベーションは行わず、直ちにフローサイトメトリーによるデータ収集に移行してください。Cytek Auroraを用いてフローサイトメトリーを行い、CFSE、BV421、BV785、PE-Cy7、DAPI、およびその他の蛍光色素のチャンネルを記録します。

共培養中、エフェクター細胞、生存標的細胞、および死細胞をリアルタイム生細胞顕微鏡を用いて可視化した。CAR2-NK-92細胞およびCAR3-NK-92細胞は、同等のエフェクター対標的比において、特に初期の時間経過でCAR1-NK-92細胞よりも速い殺傷キネティクスを示した。標的細胞の殺傷は、エフェクター対標的比が高くなるにつれて増加し、自然殺傷能を示したコントロールNK-92細胞においても同様であった。

CAR2およびCAR3 NK-92細胞は、より遅い時間点において、より低いエフェクター対ターゲット比でより高い効力を示しました。一方で、より早い時間点では、中間的なエフェクター対ターゲット比において効力の向上が観察されました。CAR-NK-92細胞の効力、殺傷キネティクス、およびエフェクター集団全体における総合的な細胞毒性性能を定量化するために、KR50、KT50、およびIKI-50という3つのパラメータが定義されました。

ダラツムマブのみを添加しても標的細胞の生存率は低下せず、エフェクター細胞が存在しない場合、この抗体が標的細胞の生存能に直接的な影響を及ぼさないことが確認されました。NK細胞のみとの共培養では、標的細胞の生存率は約70%まで低下し、ベースラインの自然細胞毒性が示されました。さらにダラツムマブを添加すると、細胞生存率は約37%まで低下し、抗体依存性細胞毒性の増強と一致する結果となりました。

対照的に、アイソタイプコントロール条件では、NK細胞のみの条件と同等の約62%の生存率を示しました。NK細胞の脱顆粒は、抗体を用いないNK細胞と標的細胞の共培養で最も低く、ダラツムマブ処理条件で最も高く約31%となり、一方でアイソタイプコントロールでは約19%の中程度の脱顆粒を示しました。このプロトコルにより、研究者はNK細胞の自然細胞傷害活性を定量し、CAR-NK設計の腫瘍殺傷能を評価し、モノクローナル抗体のADCC効率を比較することが可能になります。本プロトコルを実施する際の重要な留意点は、信頼性と解釈可能な結果を確保するために、NK細胞および標的細胞の正確で一貫した細胞計数、ピペッティング、および播種を維持することです。

今後の研究では、これらのプロトコルを活用して、NK細胞の免疫逃避の探索、腫瘍感受性の比較、およびさまざまな癌における新規のNK細胞ベースの免疫療法の評価を行うことが可能です。