神経刺激剤の徐放のためのMicroinfusionシステムの構築と注入。

こんにちは。マイルス・カニンガムです。ライアン・オコナー、シドニー・ウォングと共に、神経活性物質を継続的に投与するためのマイクロ注入システムの構築について実演します。この研究は、ハーバード大学医学部マクリーン病院の神経再構築研究室で行われました。

Sydney rbe FoundationおよびNarsadの寛大なご支援に感謝いたします。私たちは、従来の注入用カニューレよりも先端径を5〜10倍小さくした、延伸ホウケイ酸ガラス製マイクロカニューレを用いることで、脳の特定の部位に神経活性物質を確実に届けることができることを明らかにしました。このスライドでは、一般的に使用されているステンレス製注入カニューレと、当研究室で製作したマイクロカニューレを並べて示しています。

デリバリーカニューラの小型化により、研究対象となる脳領域への損傷を大幅に軽減できます。多くの従来法では、実質的に関心領域内またはその周辺に病変が生じるため、得られた結果の妥当性に疑問が残る場合があります。パネルAでは0.32 mmのカニューラによる局所領域の破壊程度が示されており、パネルBの50 µmのカニューラと比較してその差が分かります。これらの低倍率写真は、未染色のVibram切片のウェットマウント標本です。

これらの切片をさらにH&E染色し、高倍率で撮像しました。マイクロカニューレによる組織損傷の軽減をさらに説明するために、マイクロインフュージョンシステムの構成要素を示します。フランジを取り除いたステンレス製フローモジュレーターを備えたALZET mini Osmoポンプ、2〜3 cmのポリエチレンチューブ、特注のBOROSILICATEマイクロカニューレ、および28ゲージのガイドワイヤーであり、これがインプラント準備が整った組み立て済みのマイクロインフュージョンシステムです。

ここでは、所望の仕様のマイクロカニューレを作製するために、標準的な垂直型ピペットプラーを使用します。水平型プラーでも同様に作製可能です。加熱要素の温度とプラーの張力を調整することで、ボロシリケートガラス管の位置決めと固定を行います。

特定の直径と長いテーパー状のシャンクリンクを持つマイクロカニューレを、高い再現性で作製することが可能です。Boraシリカチューブを加熱し、緩やかに圧力を加えることで、チューブに目的の量の曲げを加えます。この曲げは、頭蓋骨上のクリアランスを確保し、目的とする脳ターゲットの深さに適したマイクロカニューレ先端からの距離で作成します。

このマイクロカニューレ遠位チューブの最終的な長さで、曲げ部分は約9〜10 mmです。結果に満足しなかったため、ライアンはマイクロカニューレを再度挿入し、曲げ角度を微調整して最適化します。

ダイヤモンドペンシルを使用すると、より効率的に作業できます。シドニーは、マイクロカニューレの遠位部を端から外に垂らした状態で、硬い表面にチューブをしっかりと固定し、曲がりの近位側約5mmの位置でホウケイ酸ガラスチューブを切断する方法を実演しています。彼女はチューブに円周方向に切り込みを入れます。

次に、軽く圧力をかけて、切り込みが入った接合部でチューブをきれいに折り曲げて切断します。その後、視認性を高めるために、カニューレの細い透明な先端部分に永久インクで色を付けます。拡大鏡を用いた手術中に、マイクロカニューレの先端をマイクロディセクション scissors で希望の直径まで切断します。

チップの直径は、接眼レンズまたは顕微鏡を用いて確認できます。根管整列用ワイヤーは、約3 cmの長さに切断した28ゲージのステンレス製ワイヤーを用いて作製します。次に、ピンセットを使用して、各ワイヤーの端に直径約2 mmの小さなフックを作成します。

アライメントワイヤーをペトリ皿に配置し、マイクロカニューレの中に2〜3 cmのポリエチレンチューブを挿入します。マイクロインフュージョンシステムは、ほとんどの研究室にある一般的な器具で構築できます。滅菌のため、マイクロピンセット、通常のピンセット、外科用ハサミ、および止血鉗子をサージカルドレープの上に配置します。

器具、マイクロインフュージョンシステムの構成部品、およびアルミホイル数枚を、標準的なオートクレーブを用いて滅菌します。フローモジュレーターをパッケージから慎重に取り出し、滅菌済みのペトリ皿に入れます。止血鉗子でしっかりと固定し、ステンレス製モジュレーターチューブからプラスチックフランジをハサミで取り除きます。

ミニ浸透圧ポンプをパッケージから取り出し、滅菌済みのシャーレに置きます。ステンレス製チューブをポリエチレン製チューブに2〜3 mm挿入し、光硬化性エポキシ樹脂で両者を封止します。繊細な作業には、私の神経科学研究室で使用しているLummi bondを使用します。1 CCシリンジにLummi bondを満たし、27Gの針を塗布器として使用します。強い光の下で、Lumonはわずか数秒で硬化します。

ミニ浸透圧ポンプは、ポンプを垂直に保持し、メーカー提供の充填用ニードルを用いて慎重に注入することで充填します。ポンプが完全に充填されており、欠陥がないことを確認するために、ポンプに注入される液量を観察するか、充填前後のポンプの重量を測定することを推奨します。なお、ポンプの再利用は推奨されません。

続いて、ポリエチレンチューブが接続されたモジュレーター全体をミニ浸透圧ポンプ内に挿入します。フォームモジュレーターを挿入すると、ポンプ内の液体がポリエチレンチューブへと押し出されます。液体で満たされたポリエチレンチューブの初期距離を記録し、39 °Cで12時間インキュベートした後、滅菌生理食塩水を用いてポンプを起動させると、この距離が増加することを確認してください。

作動させたミニ浸透圧ポンプを滅菌生理食塩水に浸します。これにより、マイクロインフュージョンシステムの構築における最終工程に不可欠な、気泡のない環境が確保されます。ポンプに充填されているものと同じ溶液を満たし、小口径のプラスチックチューブを装着したシリンジを用いて、ポリエチレンチューブの未充填部分から空気を押し出します。マイクロカニューラ内の空気も完全に除去してください。

同様に、ポリエチレンチューブの遠位端をマイクロピンセットで拡張する必要がある場合があり、その後、マイクロカニュラの近位端を挿入します。これでシステム全体から空気が排除され、デッドスペースがない状態になるため、生理食塩水バスから取り出し、滅菌ガーゼで水分を拭き取ることができます。次に、Luma bondを塗布して、マイクロカニュラをポリエチレンチューブに固定します。ミニ浸透圧ポンプの流量を約半分に減少させるには、滅菌したホットパラフィンを小さなシャーレに注ぎ、ミニ浸透圧ポンプの近位側半分を短時間浸します。

余分なパラフィンを拭き取り、マイクロインフュージョンシステムを滅菌生理食塩水に戻して、手術まで保管します。外科的植込の直前に、ガイドワイヤーをマイクロカニューレの屈曲部に装着します。

ガイドワイヤーの長軸を、脳組織に挿入されるマイクロカニューレの部分と平行に合わせ、ルーモンで固定します。その状態で、マイクロインフュージョンシステムを脳定位固定装置のマニピュレーターに設置します。

ガイドワイヤーをマニピュレーターアームクランプで固定し、ポンプを滅菌縫合糸のループで上から吊り下げます。これによりポンプの重量が支持され、ピンセットでガイドワイヤーを慎重に曲げることで、マイクロカニューレを頭蓋骨表面に対して完全に垂直に配置することが可能になります。その後、標準的な定位固定手術の手順に従ってマイクロ注入システムを植え込みます。ボエルチューブは接着剤を用いて頭蓋骨表面に固定します。

低プロファイルのペデスタルを形成するために、den mat Jaronを使用します。準備部位から上方に伸びている余分なガイドワイヤーを、ペデスタルの表面に合わせて切り落とします。高速ドリルに取り付けたカッティングホイールを用いて、ミニ浸透圧ポンプを動物の肩甲骨間に皮下投与します。

本手法は、従来の手法に比べて多くの利点があります。実験動物の種や年齢に合わせてカスタム製作することが可能です。また、シリカチューブを動物の頭蓋骨の表面に沿うように成形することができます。

したがって、低プロファイルでの確実な固定が可能となり、大型の頭蓋ペデスタルが不要になるため、合理化された微量注入ペデスタルの上から手術創を容易に閉鎖でき、これにより感染リスクと動物の不快感を軽減し、頭蓋骨へのシステムの固定に必要な表面積を削減できます。そのため、大型のペデスタルによる干渉を受けることなく、追加の処置や後続の手順を行うことが可能です。そして最も重要な点は、この手法が注入部位の局所環境への侵襲性と外傷を軽減し、それによって観察者効果を最小限に抑えられることです。

それが、能動的な観察が観察対象の現象に及ぼす変化です。