ヒト胚性幹細胞のミトコンドリア複合体活性の状態調査

ミトコンドリアは、代謝やエネルギー産生からプログラム細胞死、ステロイドホルモン合成に至るまで、細胞生理において数多くの役割を担っています。基礎的な細胞機能および疾患におけるミトコンドリアの重要性にもかかわらず、ヒト胚性幹細胞およびその分化後細胞におけるミトコンドリアの機能については、ほとんど分かっていません。このビデオでは、インゲル活性測定法を用いて、ヒト胚性幹細胞のミトコンドリア呼吸鎖複合体をどのように解析するかを説明します。

こんにちは。私はカリフォルニア大学ロサンゼルス校、病理学・臨床検査医学科のMichael Tetel研究室のIvan OVです。本日は、ヒト胚性幹細胞におけるミトコンドリア呼吸鎖複合体機能の評価手順について解説します。このin gel activity assayの手順には、ヒト胚性幹細胞からの粗ミトコンドリア画分の単離、高分解能のClear Native polyacrylamide gel electrophoresisによる酸化的人酸化系ミトコンドリア複合体の分離、およびその後のin gel activity assayが含まれます。

それでは開始しましょう。この手順の最初のステップは、ヒト胚性幹細胞からミトコンドリアを単離することです。このアッセイでは、フィーダーフリー条件下でマトリゲルコートプレート上で培養したヒト胚性幹細胞を使用します。

ヒトamry幹細胞からミトコンドリアを回収するために、まず温めた1x PBS pH 7.4で細胞を洗浄し、次いでトリプシン処理を5分間行います。6ウェルプレートの場合、1ウェルあたり1xトリプシンを1 mL使用してください。5分後、1x PBSに溶解したトリプシンインヒビター（1 mg/mL）を同量加えて反応を停止させ、細胞を回収します。

回収した細胞を、室温で200 ×gにて5分間遠心分離します。遠心後、上清を捨て、新しく調製した1×プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む氷冷ミトコンドリア単離バッファー0.8〜1.7 mLで、ペレット化した細胞を再懸濁します。使用するバッファーの量は、得られた細胞ペレットの大きさに合わせて調整してください。ペレットを再懸濁した後、氷上で約10分間インキュベートします。

インキュベーション後、ホモジナイザーを用いて細胞を破砕します。これには約40～50回のストロークが必要です。ホモジナイズが完全に完了したかどうかは、DOD細胞のアリコートをトリパンブルーで染色し、光学顕微鏡で観察することで確認できます。その様子は次のようになります。

これはダウンズ（downs）で50回ストロークした後の1回目のショットです。これはダウンズで80回ストロークした後の2回目のショットです。細胞を均質化した後、4 °Cで20,000 ×g、10分間遠心分離します。これにより、核や大きな細胞断片も含まれる粗ミトコンドリアペレットが得られます。

ペレットを回収する前に、後のペレット重量を推定するために回収チューブを計量し、上清を捨ててから、沈殿した粗ミトコンドリアペレットの重量を計量します。この時点でのチューブの重量を差し引くことで、次のステップで説明するペレットの可溶化に進むことができます。粗ミトコンドリアペレットを可溶化するために、まずペレットを氷上に保持し、35 µLの氷冷可溶化バッファーを加えてボルテックスします。

詳細情報を有するペレット20 mgにつき、使用する緩衝液成分は付随する書面プロトコルに記載されています。ボルテックス処理および可溶化緩衝液の添加後、ディジトニンを添加する前に、再懸濁したペレットを高速度遠心分離に適したチューブに移します。次に、ペレット重量20 mgに対して10% (w/v) ディジトニンを20 µL添加し、チューブを軽く叩いて混ぜ合わせます。十分に混合した後、ミトコンドリアペレットを氷上で5～10分間インキュベートします。タンパク質を可溶化させるために、ディジトニンの代わりにn-ドデシル-β-D-マルトシド（DDM）またはTriton X-100を代用することができます。

界面活性剤の選択およびその量は、氷上でのインキュベーション後におけるミトコンドリア複合体の超複合体またはマルチマー形態の形成に影響を及ぼす可能性があります。ペレットを可溶化した後、4°Cで100,000 ×gにて15分間遠心分離し、透明な上清を回収します。これで、ミトコンドリアのネイティブ勾配ゲル電気泳動を行うための、勾配ゲル用上清の準備が整いました。

5～13%のアクリルアミド勾配ゲルと3.5%のスタッキングゲルの使用を推奨します。ゲルの調製には、記載のプロトコルに従い、アクリルアミド・ビスアクリルアミド混合液を使用します。アクリルアミド・ビスアクリルアミド溶液はあらかじめ調製し、4°Cの暗所で保存しておきます。

アクリルアミドおよびビスアクリルアミドは、粉末および液体の両形態で毒性がある化学物質であるため、取り扱いには細心の注意を払う必要があります。アクリルアミド・ビスアクリルアミド溶液に、1.5 molar 6-アミノヘキサン酸および75 millimolar OLET（pH 7.0）で構成される3倍濃縮ゲルバッファーを分注して混合します。バッファーに添加するアクリルアミド・ビスアクリルアミド溶液の量は、グラジエントゲルを作成する際に設定するゲルのパーセンテージによって異なります。

4%混合液と13%混合液をそれぞれ1つずつ作成し、スタッキングゲルには3.5%混合液を使用します。13%混合液にグリセロールを添加することを忘れないでください。3つの混合液がすべて準備できたら、適切な量の過硫酸アンモニウムとTEMEDを添加し、混合液をグラジエント形成用キャスティングチャンバーに流し込みます。

チャンバーの左側には5%mixが含まれています。チャンバーの右側には、小型のマグネチックスターラーと共に13%mixが含まれています。チャンバーの右側を開けて、ゲルの注入を開始します。

その後、すぐにチャンバーの左側を開き、5%溶液を13%溶液と混合させてグラジエントを作成します。重合後のゲルの境界線を鋭く直線的にするため、ゲルの上部に少量のイソプロパノールを加えます。約1時間後、グラジエントゲルの重合が完了したら、イソプロパノールを取り除き、3.5%のスタッキングゲルを装置に流し込んでからゲルコームを挿入します。

ゲルの組み立てと泳動は約4～7°Cの低温室で行います。このゲルの泳動には、2種類の異なるバッファーを使用します。陽極槽には、25 mMの塩酸 pH 7.0を含むバッファーを使用します。

カソードバッファーは、50 mM Tris, 7.5 mM HCl, 0.02% (w/v) DDM (n-dodecyl-β-D-maltoside), および 0.05% (w/v) 脱キシコール酸 (pH 7.0) を含有します。先ほど作製したゲルで泳動させるための上清を調製するには、最終濃度が 5% (w/v) glycerol および 0.01% (w/v) Triton X-100 となるようにローディングバッファーを添加します。通常は、glycerol と Triton X-100 を含む 10倍濃縮ストック溶液を上清に直接添加します。

これで、サンプルをゲルにロードする準備が整いました。1レーンあたり20～40 mgの粗ミトコンドリアタンパク質を含む量をゲルのウェルにロードします。ロード後、直ちに100 Vでゲル電気泳動を行います。

サンプルがスタッキングゲルに進入したら、電流を15 milliampsに制限した状態で、電圧を500 voltsまで上げることができます。通常は70 to 100 voltsで一晩ゲルを流しますが、赤色のzos染料の鮮明なラインがゲルの先端に近づいた時点で電気泳動を停止します。ゲルの泳動が完了したので、さまざまなタンパク質複合体の活性をゲル内で直接分析することができます。

各アッセイのインキュベーション時間は、タンパク質の可溶化効率およびウェルあたりのロード量によって異なります。通常、複合体1、4、5は複合体2および3よりも強いシグナルが得られます。そのため、複合体2および3の染色時間はより長く設定する必要があります。

複合体の活性を試験するためには、各複合体に応じた特定のバッファーを使用する必要があります。個々のバッファーの成分は、記述プロトコルで確認してください。次に、インゲル活性アッセイを個別に実施するため、ゲルの各レーンを切り出します。

複合体5を除くすべての複合体について、ゲルスライスをそれぞれのバッファーに入れ、室温で数時間インキュベートします。インキュベーション後、50%メタノールおよび10%酢酸でゲルを15〜45分間固定します。固定したゲルは10%酢酸で保存します。

ここでは、複合体Iの染色結果が示されています。ゲルスライス内に、複合体Iに対応する濃い紫色のバンドが1本確認できます。ゲルが透明であれば、ミトコンドリア複合体活性のデンシトメトリー測定および比較解析を行うことが可能です。

高密度サイトメトリーの後、通常、長期保存またはスキャンによる高品質な画像の取得のためにゲルスライスを乾燥させます。複合体2は、複合体3および複合体4と同じ紫色の染色を示します。どちらもオレンジ色または黄色がかった染色バンドを与えます。以下に、複合体2、3、および4の染色活性の例を示します。

以上で、ヒト胚性幹細胞から抽出され、ネイティブゲル電気泳動を含む高分解能の手法で分離されたミトコンドリア分泌複合体の活性を分析する方法について解説しました。これで本ビデオを終了します。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。