哺乳動物細胞をトリプシン処理し、継代培養

組織培養技術は、細胞生物学の分野で広く応用されています。しかし、培養細胞を健全な状態に維持するためには、定期的なメンテナンスが必要です。細胞がコンフルエンス（飽和状態）に達すると、継代またはパッセージを行う必要があります。

これを怠ると、増殖が低下し、最終的に細胞死に至ります。このビデオでは、接着系および浮遊系の両方の細胞株における組織培養細胞の維持方法を実演します。こんにちは、私はイーストテネシーのMolecular Pathology Laboratories NetworkにあるDr.LAN's LaboratoryのRickyです。

今日は、浮遊細胞および接着細胞の継代操作における2つの手法をご紹介します。細胞プレートを継代するために、まず、60 mmのペトリ皿または25 cm²の組織培養フラスコ内でコンフルエントに増殖させ、5 mLの組織培養培地を含む一次培養細胞を用意します。

まず、滅菌ピペットを使用して、一次培養液をすべて取り除きます。次に、接着した細胞単層を、カルシウムおよびマグネシウムを含まない37 °CのHBSSの少量で1〜2回洗浄します。これは、次のステップで添加するトリプシン酵素の活性を阻害する可能性のある、残留胎牛血清を除去するためです。

次に、接着細胞層が十分に浸る量の加温したtrypsin EDTA溶液を培養液に加えます。その後、プレートを37 °Cのウォーミングトレイに1〜2分間置きます。インキュベーション後、プレートの底を平らな表面に軽く叩き、細胞を剥離させます。

倒立顕微鏡で培養状態を確認し、細胞が丸くなっている（表面から剥離していることを示す）ことを確かめます。細胞が十分に剥離していない場合は、プレートをウォーミングトレイに戻し、さらに1〜2分間待機させます。顕微鏡での確認後、完全培地でディッシュを洗浄し、懸濁液を2 mLの完全培地を含む15 mLコニカルチューブにピペットで回収します。

細胞を遠心分離してペレット化し、完全培地で再懸濁します。次に、適切にラベルを貼った新しい各プレートに、等量の細胞懸濁液を加えます。あるいは、血球計数器を用いて細胞数を計測し、目的の密度まで希釈することで、各プレートに特定の細胞数を添加することも可能です。

すべてのプレートに、継代日と継代数を必ず記載してください。細胞懸濁液を添加した後、各新規培養分に1 mLの新鮮な培地を加えます。次に、プレートを湿潤させた37 °C、5% CO2インキュベーター内で培養します。

細胞を一晩インキュベートした後、プレートに新鮮な培地を加え、37°Cに戻します。プレートがコンフルエントに達したら、この手順を繰り返して再度継代し、必要に応じて継代を継続してください。次に、浮遊培養細胞の継代方法を説明します。

浮遊培養細胞のパッケージングは、接着細胞よりも簡便です。浮遊培養細胞をパッケージングする前に、細胞がコンフルエントになるまで2〜3日おきに給餌して維持する必要があります。コンフルエントとは、フラスコを回した際に、浮遊液中で細胞が凝集し、培地が濁って見える状態を指します。

この操作を行うために、フラスコに付着して沈殿した細胞を乱さないよう注意しながら、浮遊細胞が入ったフラスコをインキュベーターから取り出します。無菌的に、フラスコから培地の約3分の1を取り除いて廃棄し、同量の37 °Cに予熱した培地で補充します。培地を交換した後、フラスコを軽く回して混ぜ、37 °C、5% CO2に設定されたインキュベーターに戻します。

フラスコ内の培地が15 mL未満の場合は、細胞と培地の接触を促進するため、フラスコを水平に置いてインキュベートします。それ以外の場合は、培地を添加しない日はフラスコを垂直に立ててインキュベートしても構いません。フラスコを swirling して細胞を再懸濁させ、状態を確認してください。

良好な代謝増殖を示す培地の色の変化を必ず観察してください。細胞がコンフルエント（1mlあたり約250万個の細胞）になったら、継代が可能です。以上で、接着細胞および浮遊細胞の両方における培養細胞の継代方法について説明しました。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。